POLITECHNIKA ŚLSKA
WYDZIAA CHEMICZNY
KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII
LABORATORIUM Z CHEMII ORGANICZNEJ
Chromatografia Cienkowarstwowa (TLC)
Prowadzący: mgr inż. Sebastian Budniok
mgr inż. Karolina Leszczyńska
mgr inż. Aurelia Zniszczoł
GLIWICE 2014
1. Wprowadzenie do chromatografii
Chromatografia jest techniką analityczną i preparatywną wykorzystującą różnice
w zachowaniu się składników mieszanin w układzie dwóch faz, w których jedna nie zmienia
swego położenia (faza nieruchoma, stacjonarna), druga zaś porusza się względem
pierwszej w określonym kierunku (faza ruchoma, roztwór rozwijający) prowadząca do
rozdzielenia mieszanin substancji na poszczególne składniki, bądz ich grupy (frakcje).
Ze względu na rodzaj dominującego mechanizmu procesu rozdziału
chromatografie możemy podzielić na:
a) adsorpcyjną - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a nieruchomą ciało stałe
o właściwościach adsorbujących i odpowiednim rozdrobnieniu (np. żel krzemionkowy, tlenek
glinowy, węgiel aktywny itp.). Adsorpcję (nagromadzenie substancji na zewnętrznej
powierzchni ciał stałych) wykorzystuje się do rozdzielenia mieszanin na podstawie różnic
w powinowactwie różnych ciał stałych na powierzchni adsorbenta.
Środki adsorbujące można podzielić na:
niepolarne (węgiel aktywny, niektóre żywice organiczne),
polarne (tlenek glinu, żel krzemionkowy, węglowodany tj. skrobia, cukier, celuloza).
W przypadku polarnego adsorbenta kolejność z jaką składniki mieszaniny pojawiają
się na płytce TLC zależy od ich względnych polarności. Tak więc w przypadku dwóch
składników różniących się polarnością składnik bardziej polarny silniej adsorbuje się na
powierzchni adsorbenta (na płytce TLC znajduje się bliżej linii startu), natomiast składnik
mniej polarny eluowany jest niepolarnym rozpuszczalnikiem (na płytce TLC znajduje się
wyżej od składnika bardziej polarnego).
b) podziałową - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a stacjonarną ciecz zatrzymana na
odpowiednim nośniku (bibuła, ziemia okrzemkowa, kulki szklane itp.). Rozdział jest
wynikiem różnic współczynników podziału.
c) jonowymienną - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a stacjonarną wymieniacz jonowy. Rozdział
zależy od różnic w sile wiązania składników przez wymieniacz.
d) żelową - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a nieruchomą granulowany, jednorodny spęczniały
żel. Rozdział jest powodowany różnicami w zdolnościach dyfundowania do cząsteczek żelu,
a więc różnicami w wielkości cząsteczek składników.
W zależności od rodzaju fazy rozdzielczej i natury substancji w której rozpuszcza
się badaną mieszaninę (eluentu) rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne (Rys. 1):
a) chromatografia gazowa to analityczna technika chromatograficzna, w której fazą
nośną jest gaz (zazwyczaj hel, argon lub wodór). Chromatografia gazowa jest
najczęściej stosowaną metodą do szybkiej analizy złożonych mieszanin związków
chemicznych oraz oceny czystości tych związków,
b) chromatografia cieczowa chromatografia, w której eluentem jest ciecz. Istotą
każdej chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na
poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny
przez stałe lub żelowe złoża. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między
związkami tworzącymi mieszaninę a złożem jedne z nich przechodzą przez złoże
szybciej a inne wolniej. Wyróżniamy tutaj:
chromatografię kolumnową w której faza rozdzielcza jest
umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie
roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można
wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie
kolumny, oraz
chromatografię planarną rozdział chromatograficzny jest prowadzony,
gdy faza stacjonarna jest w postaci cienkiej warstwy.
Chromatografię planarną można jeszcze podzielić na:
chromatografię bibułową (PC) której podstawą działania jest podział
substancji rozdzielanych miedzy fazę nieruchomą, którą stanowi
woda unieruchomiona przez celulozę dzięki jej higroskopijności, oraz
fazę ruchomą rozpuszczalnik organiczny lub mieszaninę
rozpuszczalników, często nawet z wodą, wędrujące po bibule dzięki
siłom kapilarnym. Celuloza stanowiąca nośnik dla fazy stacjonarnej
(wody) ma niewielkie właściwości adsorpcyjne i prawie nie
zniekształca przebiegu rozdzielania opartego na podziale substancji
między wodę a wędrujący rozpuszczalnik. Jeżeli współczynniki
podziału substancji naniesionych na bibułę są różne, to w trakcie
wędrówki po bibule następuje ich rozdzielenie
chromatografię cienkowarstwową (TLC) w której fazę nieruchomą
nanosi się w postaci cienkiej równomiernej warstewki na płytkę
szklaną, arkusz folii aluminiowej czy tworzywa sztucznego.
Rys. 1 Schematyczny podział chromatografii
2. Chromatografia Cienkowarstwowa
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC z ang. Thin Layer Chromatography) jest
najpopularniejszą metodą szybkiego sprawdzania postępu reakcji chemicznej i czystości
produktu. Może być także wykorzystywana do identyfikacji związków zarówno organicznych
jak i nieorganicznych. Metodę tę stosuje się w analizie mieszanin: poreakcyjnych
i uzyskiwanych z surowców naturalnych, przy potwierdzaniu identyczności składników
produktów handlowych (leki, barwniki, środki konserwujące itp.), a także przy badaniu
obecności wszelkiego rodzaju zanieczyszczeń np. w produktach spożywczych
i w środowisku naturalnym.
W TLC mieszanina substancji jest rozdzielana na poszczególne składniki ze
względu na różnicę w szybkości ich przemieszczania się na podłożu wykonanym
z aktywnego adsorbenta stanowiącego fazę nieruchomą. Poszczególne składniki mieszaniny
z różną siłą wiążą się z polarnym adsorbentem, a następnie wymywane są z niego
rozpuszczalnikiem stanowiącym fazę ruchomą. Im bardziej polarna jest badana substancja,
tym silniej wiąże się z fazą stałą i tym trudniej jest wymywana przez eluent. Im bardziej
polarny jest eluent, tym więcej polarnych centrów aktywnych fazy stałej jest przez niego
blokowane, co zmniejsza opory przesuwania się eluowanych substancji.
W chromatografii cienkowarstwowej faza stacjonarna jest naniesiona w postaci
cienkiej warstwy o grubości od 0,1 do 0,25 mm na płytkę szklaną, metalową lub
z tworzywa sztucznego o wymiarach 200200 mm, 20050 mm lub 10050 mm.
Naniesiona warstwa musi być mechanicznie trwała i odporna na ocieranie. Najczęściej do
fazy stacjonarnej dodaje się 0,1 10 % tzw. lepiszcza, którym może być gips, skrobia, sole
kwasów poliakrylowych i inne. Ze względu na detekcję substancji warstwy
chromatograficzne zawierają także często trwale zaadsorbowany wskaznik fluorescencyjny.
W chromatografii cienkowarstwowej, podobnie jak w kolumnowej, do rozdzielania są
wykorzystywane te same mechanizmy oddziaływań międzycząsteczkowych, a więc
adsorpcja, wymiana jonowa, podział, czy warunki układu faz odwróconych. Jednakże
ciągle dominującą rolę (w przeciwieństwie do chromatografii kolumnowej) odgrywa
adsorpcja, a najczęściej stosowanymi adsorbentami są:
Żel krzemionkowy jest jednym z najbardziej popularnych adsorbentów
stosowanych w chromatografii cienkowarstwowej. Jest on otrzymywany przez
hydrolizę krzemianu sodu, jego kondensację i polimeryzację w trakcie prażenia.
Jego struktura wygląda w przybliżeniu następująco:
O O O
O O O O
Si Si Si
OH OH OH
Aktywność żelu krzemionkowego zapewniają grupy Si-OH (silanolowe) obecne na
jego powierzchni. Wytwórcy kontrolują aktywność na etapie prażenia. Żel stosowany
w TLC ma średnicę ziaren w zakresie 5 10 mm.
Typy żelu krzemionkowego oznaczane są często w sposób następujący:
- Żel krzemionkowy G zawiera 13% gipsu jako czynnika wiążącego
- Żel krzemionkowy H bez środka wiążącego
- Żel krzemionkowy F z fluorescentem
254
- Żel krzemionkowy UV z fluorescentem
254
Jako fluorescent zazwyczaj stosowany jest siarczek cynku.
Żel krzemionkowy ma odczyn lekko kwaśny i może być stosowany do rozdziału
sterydów, aminokwasów, węglowodorów, tłuszczów, alkaloidów itp.
Tlenek glinu aktywność tlenku glinu związana jest z obecnością zarówno
atomów tlenu jak i glinu. Metoda produkcji polega na kondensacji uwodnionego
wodorotlenku glinu. Może on być produkowany w trzech odmianach
kwasowości powierzchni: formie kwasowej, zasadowej i obojętnej. Zasadowy
tlenek glinu z w/w jest najbardziej popularny. Tlenek glinu jest używany do
rozdziału sterydów, barwników, witamin i alkaloidów.
Celuloza naturalny polisacharyd zbudowany z cząsteczek glukozy
połączonych wiązaniami (1,4) glikozydowymi. Płytki TLC pokryte są
cząsteczkami celulozy o podobnej wielkości ziaren, co powoduje regularny
przepływ rozpuszczalnika.
Celuloza jest stosowana do rozdziału związków hydrofilowych, rozpuszczalnych
jonów nieorganicznych i kwasów nukleinowych, które mogą zbyt silnie oddziaływać
z tlenkiem glinu lub krzemionką.
Oprócz tych typowych sorbentów w chromatografii cienkowarstwowej stosuje się
także proszek poliamidowy, modyfikowane celulozy o właściwościach
jonowymiennych oraz żele organiczne o właściwościach sit molekularnych np.
Sephadex, BioGel P i inne.
Z nieorganicznych adsorbentów stosowanych w chromatografii
cienkowarstwowej można wymienić szkło sproszkowane, krzemian wapnia,
hydroksyapatyt, siarczan wapnia, tlenek cyrkonu, tlenek tytanu a nawet tlenek
żelaza.
Natomiast fazę ruchomą stanowią zazwyczaj rozpuszczalniki organiczne. Powinny
one być neutralne w odniesieniu do rozdzielanych substancji, wykazywać znaczną lotność
par, co znacznie ułatwia osiągnięcie równowagi ciecz para, i niską gęstość, co
przyspiesza usunięcie rozpuszczalnika z powierzchni płytki. W celu określenia siły
oddziaływań pomiędzy fazą ruchomą a powierzchnią nośnika wprowadzono parametr siły
rozpuszczalnika e0. Jest to energia adsorpcji na jednostkę powierzchni standardowego
adsorbenta (e0 jest równe zero na tlenku glinu eluowanym pentanem). Generalnie, im
większe wartości e0 tym silniej rozpuszczalnik oddziałuje z powierzchnią adsorbenta
i tym łatwiej cząsteczki związku będą się przemieszczały co prowadzi do większej
wartości R (Warto zauważyć, iż im większa polarność eluenta, tym większe e0). Wartości
f
R substancji w każdej fazie ruchomej będą zależne od różnicy w wartości siły
f
rozpuszczalnika. Parametr mocy rozpuszczalnika, który może być zmierzony daje szereg
elucyjny rozpuszczalników zamieszczony w tabeli poniżej (Tab. 1). Dobór odpowiedniego
układu rozpuszczalników opiera się na zasadzie: podobny rozpuszcza się w podobnym.
Zazwyczaj wykonuje się kilka prób (zmieniając polarność eluentu), dążąc do osiągnięcia
wartości R pomiędzy sąsiednimi plamkami przynajmniej 0,1 mm. Przy czym najniższa
f
z plamek powinna przesunąć się z linii startowej przynajmniej o kilka milimetrów. Często
także korzysta się z danych literaturowych.
Tab 1. Szereg elucyjny (eluotropowy) rozpuszczalników
Temperatura wrzenia
Graniczna przepuszczalność
Rozpuszczalnik e0 (Al O )
2 3
w UV [nm] [oC]
Pentan 0,001 210 36,0
Heptan 0,01 210 98,4
Cykloheksan 0,04 210 81,0
Disiarczek węgla 0,15 380 45,0
Czterochlorek węgla 0,18 265 76,7
Eter diizopropylowy 0,28 220 69,0
Toluen 0,29 285 110,6
Chlorobenzen 0,30 280 132
Benzen 0,32 280 80,1
Eter dietylowy 0,38 220 34,6
Chloroform 0,40 245 61,2
Dichlorometan 0,42 245 41,0
Tetrahydrofuran 0,45 220 65,0
1,2-Dichloroetan 0,49 230 84,0
Aceton 0,56 330 56,2
1,4-Dioksan 0,56 220 104,0
Octan etylu 0,58 260 77,1
Octan metylu 0,60 260 57,0
Dimetylosulfotlenek 0,62 270 190,0
Nitrometan 0,64 3809 100,8
Acetonitryl 0,65 210 80,1
Pirydyna 0,71 305 115,5
Izopropanol 0,82 210 82,4
Etanol 0,88 210 78,5
Metanol 0,95 210 65,0
Glikol etylenowy 1,11 210 198,0
Kwas octowy Bardzo duży 251 118,5
W wielkim uproszczeniu zjawiska zachodzące w komorze chromatograficznej można
przedstawić następująco: faza ruchoma dzięki siłom kapilarnym migruje wzdłuż warstwy
sorbentu (fazy stacjonarnej) i w zależności od energii oddziaływań substancji z fazami
wykazują one różny stopień retencji, tzn. mają różną drogę migracji i znajdują się w różnych
miejscach warstwy.
Rys. 2 Schematyczny obraz procesów zachodzących w czasie rozwijania chromatogramu na
płytce chromatograficznej
Najbardziej powszechnym sposobem rozwijania płytek chromatograficznych jest sposób
liniowy, który w najprostszej postaci wymaga tylko kontaktu jednego końca płytki (warstwy
chromatograficznej) z rozpuszczalnikiem. Płytkę chromatograficzną ustawia się
w pozycji pionowej bądz pod kątem w kilku mililitrach rozpuszczalnika w odpowiednim
pojemniku zwanym komorą chromatograficzną Rozwijanie liniowe może być jednokierunkowe
lub dwukierunkowe. Płytkę można rozwijać pojedynczo lub wielokrotnie.
W rozwijaniu jednokierunkowym faza ruchoma przesuwa się w jednym kierunku zaś rozwijanie
dwukierunkowe polega na tym, że po pierwszym rozwinięciu płytkę suszy się
w celu usunięcia rozpuszczalnika a następnie zanurza w tym samym rozpuszczalniku lub
innym, ale obróconą o 90 stopni. Przy wielokrotnym rozwijaniu płytkę po każdej analizie
suszy się i ponownie rozwija stosując taką samą fazę ruchomą lub inną. Efektem tego
sposobu rozwijania jest zwężenie pasma stężeniowego substancji i związane z tym zwiększenie
sprawności układu jak również zwiększenie czułości metody.
Po rozwinięciu płytki chromatograficznej i wysuszeniu wizualizacje plamek na
warstwie chromatograficznej można dokonać m.in. metodami fizycznymi, chemicznymi lub
biologicznymi.
Do metod fizycznych zaliczamy fotometrie absorpcyjną, fluorescencje, fosforescencje
(w przypadku substancji znakowanych izotopami promieniotwórczymi) oraz metody
radiometryczne. Metody te nie powodują uszkodzenia próbki co ma istotne znaczenie jeśli
stosuje się chromatografie cienkowarstwową do celów preparatywnych.
Do wizualizacji plamek można także wykorzystać metody chemiczne. Wówczas
rozdzielane substancje przeprowadza się w substancje barwne stosując do tego celu reagenty
chemiczne, które ulegają reakcji z wybranymi grupami funkcyjnymi. Stosunkowo często
stosowanym wywoływaczem jest stężony kwas siarkowy. Proces wywoływania polega na
spalaniu substancji organicznych i pojawianiu się ciemnych plam na warstwie
chromatograficznej. Inne popularne wywoływacze zostały zamieszczone w tabeli 4.
Natomiast biologiczne metody wywoływania chromatogramów mają zastosowanie
w badaniach substancji czynnych, występujących w żywych ustrojach, np. enzymów,
koenzymów, aktywatorów i inhibitorów enzymatycznych. Na przykład w badaniach przemian
enzymatycznych nanosi się badany materiał na bibułę i rozpyla roztwór preparatu
enzymatycznego. Inkubację przeprowadza się w termostacie w temp. 37-38C, a po jej
zakończeniu, rozwinięciu chromatogramu i wywołaniu właściwym testem, identyfikuje się
produkty reakcji enzymatycznej.
Tabela 4. Roztwory stosowane do wizualizacji substancji na płytkach TLC
Związek chemiczny Układ wywołujący
Aldehydy alifatyczne Chlorowodorek hydrazonu 3-metylo-2-benzotiazolinonu
Alkaloidy Heksachloroplatynian potasu, ninhydryna
Antybiotyki Ninhydryna
Aminokwasy Ninhydryna
Węglowodany Roztwór kwasu siarkowego w metanolu
Lipidy Chlorek antymonu(III), błękit tymolowy, ninhydryna, rodamina B
Kwasy karboksylowe Zieleń bromokrezolowa
Fenole Chloranil, kwas fosfomolibdenowy
Terpeny Kwas fosfomolibdenowy
Wykonanie analizy TLC
Badane substancje (10-20 mg) rozpuszcza się w niewielkiej ilości rozpuszczalnika ok.
0.5 ml. Substancja powinna być dobrze rozpuszczalna w zastosowanym rozpuszczalniku,
najczęściej stosuje się roztwory w metanolu, acetonie, chloroformie. W przypadku substancji
bardzo polarnych np. aminokwasy do roztworu można dodać 1 kroplę wody. Przygotowuje
się płytkę chromatograficzną o wymiarach zależnych od ilości substancji jakie zamierza się
nałożyć na płytkę. Na przygotowanej płytce zaznacza się przy użyciu zwykłego ołówka
punkty, na które następnie nanosi się roztwory substancji badanych, przy pomocy szklanej
kapilary, w odległości ok. 0.5 cm od bocznej krawędzi płytki oraz ok. 0.5 cm od dolnej
krawędzi. Roztwór nanosi się lekko dotykając powierzchni płytki końcem kapilary(czynność
można powtórzyć kilkakrotnie). Dobrze naniesiona substancja tworzy na płytce tzw.
plamkę o średnicy ok. 2 mm. Po nałożeniu wszystkich substancji płytkę suszy się,
a następnie ostrożnie zanurza się dolną krawędzią w roztworze rozwijającym, znajdującym
się w komorze chromatograficznej, tak by nie zanurzyć plamek. Komora powinna być
umieszczona pod sprawnie działającym wyciągiem. Rolę komory chromatograficznej
z powodzeniem spełnia zwykły słoik przykryty szkiełkiem zegarkowym. Dla lepszego
nasycenia komory parami rozpuszczalnika, ścianę boczną komory wyściela się paskiem
z bibuły. Czoło rozpuszczalnika powoli przemieszcza się po płytce, aż do osiągnięcia linii
końcowej tj. ok. 5 mm od górnej krawędzi płytki. Wówczas płytkę ostrożnie wyjmujemy
z komory. Rozpuszczalnik pozostały na płytce usuwa się za pomocą zwykłej suszarki do
włosów. W przypadku związków absorbujących w UV, wizualizację plamek dokonuje się
przez włożenie płytki do komory lampy UV, pod warunkiem, że adsorbent znajdujący się na
płytce zawiera dodatek fluorescenta. Wtedy na żółto zabarwionej w świetle UV płytce
substancje widać jako ciemne plamki. Inna metoda wizualizacji plamek polega na
umieszczeniu płytki w komorze jodowej lub krótkotrwałym zanurzeniu w naczyniu
z odpowiednim roztworem wywołującym a następnie wygrzaniu płytki w podwyższonej
temperaturze (zazwyczaj nie wyższej niż 120 oC). Wraz z przesuwaniem się rozpuszczalnika
przemieściły się nałożone substancje. Szybkość ich przemieszczania jest ich cechą
indywidualną i zależy od ich powinowactwa do podłoża płytki (adsorbcja) i wymywania
(desorpcja). W wyniku różnej szybkości migracji poszczególnych substancji w danych
warunkach, na płytce chromatograficznej powstaje seria plamek w różnej odległości od linii
startowej. Położenie plamek zaznacza się przez lekkie obrysowanie ich krawędzi ołówkiem
bezpośrednio po wywołaniu. Następnie obliczamy tzw. współczynnik R (współczynnik
f
retencji). Mierzy się odległość środka plamki od linii startowej (w mm) i dzieli przez dystans
pomiędzy linią startową i końcową też w mm. Pomiaru i obliczenia R dokonuje się dla każdej
f
plamki. Na rys.2 przedstawiono sposób pomiaru R .
f
a a'
a''
Rf '' =
Rf = ; Rf ' = b ; b
b
b
a
a'
a''
x x x
Rys. 2. Sposób pomiaru i obliczania R .
f
Odmianą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) jest preparatywna chromatografia
cienkowarstwowa (PTLC) którą stosuje się w celu izolacji znacznie większych ilości
substancji, które następnie mogłyby być stosowane dla celów preparatywnych. Jest to
możliwe gdyż stosuje się płytki o znacznie większych wymiarach niż analityczne. Najczęściej
stosowane są płytki wymiarach 20x20 cm i grubości warstwy 1,0-2,0 mm. Postępowanie
w przypadku stosowania preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej jest podobne jak
w przypadku stosowania konwencjonalnej czy wysokosprawnej warstwy. Na warstwę
chromatograficzną nakłada się rozdzielaną mieszaninę substancji w formie paska lub plamek
obok siebie. Ilość nakładanej substancji zależy od grubości warstwy żelu oraz od trudności
rozdzielczych w danym układzie. Po rozwinięciu płytki w komorze zawierającej układ
rozwijający i po wysuszeniu płytkę wywołuje się stosując metody nieinwazyjne jak np.
wizualizację za pomocą lampy UV.
3. Wykonanie ćwiczenia
Ćwiczenie składa się z trzech części:
I. Wpływ polarności fazy ruchomej na R
f
Z dużej płytki należy wyciąć trzy paski o długości 8 cm i szerokości 1,5 cm. Ołówkiem
nanosi się, na każdym z nich, w odległości ok. 10 mm od dolnej krawędzi płytki,
punkt startowy. Za pomocą kapilary nanosi się na każdą płytkę kilka mikrolitrów
roztworu aminy aromatycznej a następnie, po wysuszeniu, ostrożnie zanurza się dolną
krawędz płytki w roztworze rozwijającym. Pierwszą z płytek rozwija się w układzie:
heksan:octan etylu (1:1) (roztwór A), drugą: metanol:chloroform (1:4) (roztwór B),
trzecią: metanol:chloroform:r-r amoniaku (1:1:0.03) (roztwór C). Gdy czoło
rozpuszczalnika osiągnie poziom ok. 5 mm od górnej krawędzi, płytkę należy wyjąć
z komory, odrysować czoło fali i po wysuszeniu umieścić w komorze jodowej. Po
wybarwieniu plamki należy zakreślić ołówkiem a następnie obliczyć R .
f
II. Analiza jakościowa - reakcje barwne związków organicznych
Przed tym ćwiczeniem każdy otrzymuje indywidualną próbkę do analizy, zawierającą jedną
z substancji: aminokwas, amina aromatyczna, monosacharyd.
Przygotować dwie płytki o wymiarach 2 cm x 1,5 cm.
Na pierwszą nanosimy próbkę aminokwasu oraz otrzymaną próbkę a na drugą monosacharyd
oraz otrzymaną próbkę. Płytkę pierwszą wywołuje się przez spryskanie roztworem
ninhydryny a następnie wygrzewanie w podwyższonej temperaturze. Aminokwasy
wybarwiają się na kolor czerwony do fioletowego. Płytkę z naniesionym monosacharydem
wybarwia się przez spryskanie roztworem kwasu siarkowego i wygrzanie w podwyższonej
temperaturze. Monosacharydy wybarwiają się na kolor od zielonego do czarnego.
Porównać reakcje barwne wzorców z próbką.
Uwaga: wygrzewanie należy przeprowadzić ostrożnie, zbyt gwałtowne ogrzanie może
doprowadzić do ściemnienia całej powierzchni płytki, co uniemożliwi obserwację plamek.
III. Analiza jakościowa właściwa analiza TLC
Na płytce o wymiarach 4 x 3 cm zaznaczamy cztery punkty startowe w odległości ok. 0,5 cm
jeden od drugiego. Na zaznaczone punkty nanosimy roztwory wzorcowe w kolejności:
aminokwas, monosacharyd, amina aromatyczna oraz roztwór próbki badanej. Płytkę
umieszczamy w komorze zawierającej roztwór B metanol:chloroform (1:4). Po
rozwinięciu, wywołujemy osuszoną płytkę w jodzie. Obrysowujemy powstałe plamki.
Obliczamy R . Następnie desublimujemy jod z powierzchni płytki poprzez wygrzanie
f
strumieniem ciepłego powietrza. Płytkę spryskujemy roztworem ninhydryny, wygrzewamy
i obrysowujemy powstałe plamki. Postępujemy analogicznie z roztworem kwasu siarkowego.
Wizualizację dokonujemy również w komorze lampy UV.
Na podstawie względnego położenia plamek i ćwiczenia II należy określić prawdopodobną
przynależność związku nieznanego do jednej z trzech klas: aminokwasy, aminy
aromatyczne, monosacharydy.
Zaliczenie ćwiczenia
Zaliczenie ćwiczenia następuje po poprawnym wykonaniu wszystkich trzech składowych
elementów analizy TLC, na podstawie opracowanego sprawozdania (wnioski!!!), oraz
pozytywnym napisaniu kolokwium zaliczeniowego.
UWAGA!!!!
Na ćwiczenia każdy student powinien przynieść: okulary, fartuch (zakładamy PRZED wejściem
do laboratorium), rękawiczki np. nitrylowe, ołówek, linijkę, nożyczki, taśmę klejącą oraz zeszyt
laboratoryjny. Dodatkowo na grupę mydło, płyn do mycia naczyń i ścierkę. Jest to warunkiem
przystąpienia do zajęć!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
W miarę możliwości uprasza się studentów pierwszych 3 grup odbywających laboratorium TLC
o przyniesienie kompletnych słoiczków o poj. 500 ml.
LITERATURA
1. Chromatografia cieczowa praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego,
CEEAM, Gdańsk 2004
2. Z. Witkiewicz Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995
3. Berthillier - Chromatografia i jej zastosowanie - PWN, 1975.
4. Opieńska-Blauth, H. Kraczkowski, H. Brzuszkiewicz - Zarys chromatografii
cienkowarstwowej - PWRiL, 1971, 1976.
5. Irena Baranowska - Wybrane działy analizy instrumentalnej
SPRAWOZDANIE (drukowane dwustronnie)
Temat: Chromatografia Cienkowarstwowa (TLC)
Prowadzący: mgr inż. Karolina Leszczyńska
Data wykonania ćwiczenia:
Sprawozdanie oddane, ocena:
Imię, Nazwisko oraz numer grupy:
CZŚĆ I Wpływ polarności fazy ruchomej na wartość Rf (przebieg, obserwacje, wnioski)
Cel ćwiczenia:
Przebieg:
Wnioski:
CZŚĆ II Analiza jakościowa-reakcje barwne (przebieg, obserwacje, wnioski)
Cel ćwiczenia:
Przebieg:
Wnioski:
CZŚĆ III Analiza jakościowa właściwa analiza TLC (przebieg, obserwacje, wnioski)
Cel ćwiczenia:
Przebieg:
Wnioski:
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
owiadczenie do obrony od 2014 2015INstrukcje 2013 na 2014SCIC TWZ 2014 2015Egzamin I termin zima 2014 2015 TCH WIiTCHPatomorfa wejściówki 2014 2015(1)TEST 2014 2015 Wojewodzki Konkurs Fizyczny etap wojewódzkiplan semestr letni 2014 2015konsultacje semestr letni instytut zarządzania 2014 2015The Official UK Top 100 Biggest Songs of 2014 (2015) TracklistaPrzykad sprawdzian LTP 2014 2015(1)TEST 2014 2015 Wojewodzki Konkurs Fizyczny etap rejonowyReologia farmaceutyczna 2014 2015Szałucki NOP Wykłady 2014 2015przykładowa matura cke biologia 2014 2015DVD Comand APS 2014 2015 v15 0PYTANIA Z WYKŁADÓW 2014 2015Kodowanie materiały (sem zimowy 2014 2015)więcej podobnych podstron