2010-05-15
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
KWASY NUKLEINOWE
odgrywają główną rolę w
przechowywaniu i ekspresji
K W A S Y N U K L E I N O W E
K W A S Y N U K L E I N O W E
informacji genetycznej
wyróżnia się dwie klasy tych związków: zasady
azotowe
DNA (kwas deoksyrybonukleinowy)
pary zasad
bierze udział wyłącznie w przechowywaniu
szkielet
cukrowo-
informacji fosforanowy
Biochemia materiały do konwersatorium 5A
RNA (kwas rybonukleinowy)
studia niestacjonarne 2009/10 uczestniczy w ekspresji genów i biosyntezy
białek
1 2
3
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
TWORZENIE KOMPLEKSÓW Z BARWNIKAMI WYKRYWANIE
KWASÓW NUKLEINOWYCH
w środowisku kwasowym kwasy nukleinowe wiążą barwniki zasadowe
(hematoksylina, błękit metylenowy, zieleń malachitowa, pironina)
zastosowanie: histochemia, barwienie jąder komórkowych
kwasy nukleinowe tworzą z białkami zasadowymi
wykorzystane w technice prążkowego barwienia chromosomów metafazowych
oraz niektórymi białkami obojętnymi połączenia
do wykrycia prążków
kompleksowe SZTUCZNE NUKLEOPROTEIDY,
PRŻKI
DNA w obecności kw. octowego i r-ru białka (np. BSA, albumina jaja)
są wynikiem kondensacji kw. nukleinowych pod wpływem barwników
wytrąca się w postaci białego osadu (kompleksowe połączenie białka z DNA)
ułożone poprzecznie w stosunku do długiej osi chromatyd
różnią się szerokością i intensywnością wybarwienia
w komórce większość kwasów nukleinowych występuje w formie
ciemne prążki odpowiadają fragmentom z dużą zawartością A T
NUKLEOPROTEIN
prążki G: barwienie odczynnikiem Giemsy
chromosomy eukariotyczne zawierają DNA i białko:
prążki Q: barwienie kwinakryną
HISTONY stanowią wagową większość białek
jasne prążki duża zawartość genów aktywnych transkrypcyjnie, inny skład
białek, prążki R (ang. Reverse)
BIAAKA NIEHISTONOWE (NHP)
CHROMARYNA = DNA + białko
WZORY PRŻKOWE
pozwalają identyfikować chromosomy, zlokalizować określone geny
4
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
6
BUDOWA DNA
ROZPUSZCZALNOŚĆ
KWASÓW NUKLEINOWYCH
cegiełkami budulcowymi DNA są 4 różne monodeoksyrybonukleotydy
NUKLEOTYD = kwas ortofosforowy + nukleozyd
polianiony (reszty fosforanowe) odczyn kwasowy
NUKLEOZYD = zasada azotowa + pentoza
NUKLEOPROTEINY dobrze rozpuszczajÄ… siÄ™ w
wodzie
nukleozyd
nukleotyd
wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczajÄ… siÄ™ w
zasada azotowa
roztworach zasadowych, słabo w rozcieńczonych
kwasach i wodzie
w roztworach wodnych tworzą koloidy, z których
łatwo można je wytrącić odczynnikami
odwadniajÄ…cymi, np. etanolem, izopropanolem
grupa
fosforanowa
cukier - pentoza
5
1
2010-05-15
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
trifosforan adenozyny
NUKLEOZYDY I NUKLEOTYDY
difosforan adenozyny
monofosforan adenozyny
zasada + cukier = NUKLEOZYD
adenozyna
np.
adenina + ryboza = adenozyna
adenina + deoksyryboza = deoksyadenozyna
adenina
wiÄ…zanie fosfoestrowe
cytozyna + ryboza = cytydyna
cytozyna + deoksyryboza = deoksycytydyna
zasada + cukier + fosforan = NUKLEOTYD
miejsce
np.
przyłączenia
monofosforan adenozyny (AMP)
zasady
difosforan adenozyny (ADP) azotowej
grupa fosforanowa
trifosforan adenozyny (ATP)
monofosforan deoksyadenozyny (dAMP)
miejsce ryboza
difosforan deoksyadenozyny (dADP) przyłączenia
fosforanu
tirfosforan deoksyadenozyny (dATP)
8
7
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
WIZANIA
HYDROLIZA KWASÓW NUKLEINOWYCH
FOSFODIESTROWE
1
4
3 2
łączą nukleotydy w łańcuch stosując różne czynniki hydrolizujące i różny czas trwania
polinukleotydowy hydrolizy uzyskujemy różne produkty reakcji
5
ortofosforan jest podwójnie
MOCNE KWASY powodujÄ… hydrolizÄ™:
zestryfikowany grupami OH cukru
*wiązań estrowych pomiędzy nukleotydami
pierwsze WIZANIE ESTROWE *wiązań estrowych pomiędzy pentozą a kwasem fosforowym
utworzone jest pomiędzy resztą
*wiązań glikozydowych między pentozą a zasadą
ortofosforanowÄ… a grupÄ…
hydroksylowÄ… przy C-3
produktami mogą być
deoksyrybozy jednego nukleotydu
NUKLEOTYDY, NUKLEOZYDY, ZASADY PURYNOWE I
drugie WIZANIE ESTROWE Å‚Ä…czy
PIRYMIDYNOWE, WOLNY CUKIER oraz
ten sam ortofosforan z grupÄ… OH
ORTOFOSFORAN
przy C-5 deoksyrybozy następnego
nukleotydu
9 10
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
PENTOZY KWASÓW NUKLEINOWYCH
HYDROLIZA KWASÓW NUKLEINOWYCH
cukier obecny w RNA cukier obecny w DNA
RYBOZA DEOKSYRYBOZA
kwasy
RNA jest odporne na hydrolizę rozcieńczonymi kwasami
DNA ulega depurynacji pod wpływem rozcieńczonych kwasów
obydwa kwasy nukleinowe ulegają hydrolizie pod wpływem
stężonych kwasów nukleinowych
zasady przy C2 obecny jest tlen przy C2 brak tlenu (deoksy-)
RNA ulega hydrolizie pod wpływem rozcieńczonych zasad
w rybozie dwie sÄ…siadujÄ…ce z brak grupy OH w deoksyrybozie
DNA nie jest wrażliwe na działanie zasad
sobą grupy OH: 2 i 3 czynią sprawia, że DNA jest odporne na
RNA bardziej wrażliwe na hydrolizę zasadową (DNA jako
hydrolizę zasadową (RNA materiał genetyczny musi być
DNA jest bardzo trwały, co wynika z obecności deoksyrybozy i
mniej stabilny po wypełnieniu stabilny)
dwupasmowości nici tego kwasu
11 12
zadania jest niszczony)
2
2010-05-15
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
WYKRYWANIE PENTOZ ODRÓŻNIANIE RNA OD DNA
PRÓBA BIALA
PRÓBY KONDENSACYJNE
próba kondensacyjna: ryboza ogrzewana ze stęż. HCl
pentozy w środowisku kwaśnym ulegają odwodnieniu
tworzy furfural, który kondensuje z orcyną tworząc
do cyklicznych aldehydów powstaje furfural, który
zwiÄ…zek o zielonym zabarwieniu
kondensujÄ…c ze zwiÄ…zkami aromatycznymi tworzy
stosowana do odróżniania pentoz od heksoz (pentozy
zwiÄ…zki barwne
zabarwienie oliwkowozielone, heksozy żółtobrązowe)
PRÓBA TAUBERA z benzydyną
ODCZYN DISCHEGO
PRÓBA TOLLENSA z floroglucyną
deoksyryboza ogrzewana w obecności stężonych
stosowana do odróżniania pentoz od heksoz (pentozy
kwasów tworzy kwas ´-hydroksylewulinowy, który
zabarwienie czerwone, heksozy żółtobrunatne)
reagujÄ…c z difenyloaminÄ… daje zwiÄ…zek o barwie
niebieskiej
13 14
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
ZASADY AZOTOWE KWASÓW NUKLEINOWYCH
WIZANIE ²-N-GLIKOZYDOWE
²
²
²
ZASADY PIRYMIDYNOWE: cytozyna C (DNA, RNA)
tymina T (DNA)
uracyl U (RNA)
do każdej cząsteczki cukru w pozycji C-1
ZASADY PURYNOWE : adenina A (DNA, RNA)
przyłączona jest zasada azotowa wiązaniem
guanina G (DNA, RNA)
²-N-glikozydowym przez atom azotu
N-9 PURYN
N-1 PIRYMIDYN
tymina uracyl cytozyna adenina guanina
15 16
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
PIRYMIDYNA I PURYNA
URACYL TYMINA
5-METYLOURACYL
pierścieniowe związki heterocykliczne
PIRYMIDYNA PURYNA
pierścień imidazolowy skondensowany
z pirymidynowym stanowi szkielet
tymina jest metylowanÄ… pochodnÄ… uracylu
puryny (imidazolopirymidyna), rzadko
występuje w przyrodzie, stanowi
prekursor zasad purynowych
17 18
3
2010-05-15
20
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
KONFORMACJE DNA
WAAÅšCIWOÅšCI ZASAD AZOTOWYCH
konformacja wiÄ…zania N-glikozydowego
zależna od pH tautomeria keto-enolowa, mniej trwała postać
ustawienie zasad azotowych względem pierścienia furanowego:
enolowa jest bardziej aktywna niż trwała ketonowa
konformacja anti w DNA grupy ketonowe zasad pirymidynowych lub
sześcioczłonowe pierścienie zasad purynowych są położone poza
guanina
pierścieniem furanowym
konformacja syn przeciwna do anti, występuje tylko w Z-DNA
FORMA KETONOWA FORMA ENOLOWA
laktam laktym
mocna absorbancja w świetle UV (w pierścieniach występują
heteroatomy oraz układy wiązań podwójnych)
syn guanina anti guanina anti uracyl
19
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
ZAPIS SEKWENCJI NUKLEOTYDOWEJ
ORGANIZACJA CZSTECZKI DNA
do identyfikacji poszczególnych nukleotydów stosuje się
pojedyncze litery odpowiadające skrótom zasad azotowych:
Struktury:
A, G, C, U, T
I-rzędowa nukleotydy połączone w łańcuch
polinukleotydowy wiązaniami kowalencyjnymi sekwencję pierwszorzędową DNA zapisuje się w kierunku 5 3
II-rzędowa struktura podwójnej helisy, formy A, B, C,
jeśli fosforan dołączony do grupy OH przy węglu 5 stosuje się
D, E, T (prawoskrętne) i Z (lewoskrętna)
zapis: pN (p fosforan, N dowolna zasada):
III-rzędowa podwójna helisa ulega dalszym
5 -pApTpC-3 , ufosforylowana jest grupa OH przy C5 ,
ukształtowaniom przestrzennym (np. kolisty DNA
-OH przy C3 jest wolna
plazmidów, Eukaryota mitochondrialny i
najczęściej stosuje się formę skróconą zapisu: ATC
chloroplastowy DNA)
jeśli fosforan dołączony do grupy OH przy węglu 3 stosuje się
zapis: Np (p fosforan, N dowolna zasada)
21 22
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
rowek
mniejszy
FORMY DNA
FORMY DNA
rowek
różnią się kierunkiem skręcenia helisy,
większy
długością skrętu helisy oraz ilością par
nukleotydów przypadających na jeden skręt (skok)
A-DNA mniej rozciągnięta niż forma B
* prawoskrętna podwójna helisa
A-DNA B-DNA Z-DNA
B-DNA główna forma DNA
* dł. skrętu: 2.6 nm
* kÄ…t skrÄ™tu pary zasad: 33º
* cząsteczka ma kształt prawoskrętnej regularnej helisy,
* na 1 skręt przypada nawet 11 par nukleotydów
utworzonej przez dwa antyrównoległe łańcuchy
* dwa rowki
* na 1 skręt przypada 10 par nukleotydów
* mniejszy stopień uwodnienia niż w B-DNA
* długość skrętu 3.4 nm
* każda kolejna para zasad jest skręcona w stosunku do Z-DNA zagęszczenie GC (naprzemiennie występują nukleotydy
purynowe i pirymidynowe)
poprzedniej o 36º
* zasady azotowe są dosunięte od osi helisy
* zasady azotowe położone są centralnie bez przesunięć
* lewoskrętna podwójna helisa
* na jeden skręt przypada 12 par nukleotydów
* można wyróżnić w niej 2 rowki mniejszy i większy
* kształt zygzakowaty nici, co wynika z nagromadzenia par GC
23 * jeden mniejszy rowek 24
4
2010-05-15
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
26
WIZANIA W CZSTECZCE DNA
WIZANIA WODOROWE
ZASADA AZOTOWA + DEOKSYRYBOZA
wiÄ…zanie N-glikozydowe
DNA zbudowany jest z dwóch wzajemnie oplatających się
nici, tworzÄ…cych helikalnÄ… strukturÄ™
NUKLEOZYD + ORTOFOSFORAN
nici ułożone antyrównolegle
wiązanie fosfoestrowe zasady znajdujące się w przeciwległych łańcuchach tworzą
ze sobÄ… WIZANIA WODOROWE:
NUKLEOTYD
A = T
C a" G
wiÄ…zanie fosfodiestrowe
tworzÄ… siÄ™ KOMPLEMENTARNE PARY ZASAD
AACCUCH KWASU NUKLEINOWEGO
wiÄ…zania wodorowe
PODWÓJNA HELISA DNA
25
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
DENATURACJA DNA DENATURACJA DNA W ZMIENIONYM pH
jonizacja zasad - zerwanie wiązań wodorowych pomiędzy zasadami
topnienie DNA (ang. melting) zaburzenie powłoki hydratacyjnej DEPURYNACJA i
DEPIRYMIDYZACJA utrata zasad przez niszczenie wiÄ…zania
separacja podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze nici
²-N-glikozydowego
wskutek zerwania wiązań wodorowych
pod wpływem zasad, kwasów lub w trakcie ogrzewania
roztworu
DENATURACJA CIEPLNA DNA
temperatura, w której 50% składu próbki DNA ulega
denaturacji nazywa siÄ™ temperaturÄ… topnienia Tm
wysoka temperatura powoduje utratę struktury drugorzędowej DNA
istnieje zależność pomiędzy zawartością par C a" G a
ciepło zaburza wiązania wodorowe i powłokę hydratacyjną,
temperaturą topnienia DNA: im większa zawartość par co zmniejsza siły utrzymujące obie nici polinukleotydowe razem
CG tym wyższa temperatura topnienia
27 28
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
29
RENATURACJA DNA
EFEKT HIPO- i HIPERCHROMOWY
denaturację termiczną, zachodzącą w trakcie ogrzewania, można
odtworzenie struktury dwuniciowej podczas oziębiania
śledzić, badając wzrost absorbancji przy dł. fali 260 nm
zdenaturowanego roztworu DNA
EFEKT HIPERCHROMOWY: absorbancja jednoniciowego DNA
(ssDNA) jest znacznie wyższa niż absorbancja dwuniciowej helisy możliwa tylko wtedy, gdy roztwór ogrzano do temperatury
DNA (dsDNA)
niższej niż Tm
EFEKT HIPOCHROMOWY
zależy od stężenia DNA w roztworze: możliwa jest przy
dsDNA wykazuje
obniżoną zdolność niedużym rozcieńczeniu
do pochłaniania UV
w porównaniu z ssDNA
przypadkowe
zwoje
podwójna helisa
ogrzewanie
jednoniciowego
DNA
powolne schładzanie
natywne DNA zdenaturowane DNA
temperatura [C]
30
5
absorbancja - UV
2010-05-15
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
WIZUALIZACJA DNA
AGAROZA
barwniki fluorescencyjne
polisacharyd otrzymywany z glonów morskich, główny
BROMEK ETYDYNY interkalator
składnik agaru
SYBR Green (25-krotnie bardziej czuły niż EtBr)
zbudowana z powtarzajÄ…cych siÄ™ jednostek
DAPI powszechnie używany do barwienia jąder
²-D-galaktopiranozy i 3,6-anhydro-Ä…-L-galaktopiranozy
komórkowych w mikroskopii fluorescencyjnej
połączonych wiązaniami 13 oraz 14
barwnik HOECHST A (mikroskopia fluorescencyjna,
rozpuszczona w roztworze wodnym w stężeniach > 0.1% i
cytometria przepływowa)
temp. niższej od 40ºC zestala siÄ™, tworzy żel (najczęściej
stosowane stężenia żelu 0.5 3%)
podczas ochładzania łańcuchy polisacharydowe tworzą
podwójne helisy, które łączą się w pęczki i tworzą stabilny żel
(wielkość oczek zależy od stężenia agarozy, dopasowuje się do
wielkości rozdzielanych fragmentów DNA)
jądra komórek czerniaka
wybarwione DAPI
31 32
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
INTERKALACJA DO DNA
BROMEK ETYDYNY
INTERKALACJA niekowalencyjne oddziaływanie związku z
EtBr, zbudowany z 4 pierścieni aromatycznych
DNA; czÄ…steczki o charakterze aromatycznym, policyklicznym
wnika (interkaluje) pomiędzy sąsiednie
o płaskich cząsteczkach wnikają pomiędzy pary zasad w
pary zasad azotowych dwuniciowego DNA
podwójnej helisie DNA
pod wpływem ultrafioletu EtBr emituje światło o zabarwieniu
konsekwencja: zaburzenie struktury DNA
pomarańczowym - intensywność fluorescencji EtBr znacząco
rozsunięcie zasad azotowych (rozciągnięcie łańcucha DNA),
wzrasta po zwiÄ…zaniu do DNA dwunicowego, powinowactwo EtBr
zwiększenie średnicy DNA,
do jednoniciowego jest słabsze niż dwuniciowego
zmiana kąta skręcenia podwójnej helisy
po umieszczeniu wybarwionego EtBr żelu w TRANSILUMINATORZE
w świetle UV można oglądać świecące prążki
INTERKALATORY uszkadzajÄ… strukturÄ™ DNA, prowadzÄ… do
uwaga! silny mutagen!
nieprawidłowego funkcjonowania DNA jako matrycy (błędy
wszystkie czynności wykonujemy w rękawiczkach nitrylowych
replikacji)
33 34
Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe Konwersatorium 5A Kwasy nukleinowe
ELEKTROFOREZA KWASÓW NUKLEINOWYCH
BUFORY DO ELEKTROFOREZY
AGAROZOWEJ
bufor TAE fragmenty DNA żel agarozowy
DNA przemieszcza
siÄ™ w polu
katoda anoda
bufory :TAE, TBE elektrycznym od
ujemnej elektrody
"T" Tris, decyduje o pH
(katody) do
dodatniej elektrody
"E" EDTA, chelatuje jony dwuwartościowe
(anody),
których nukleazy potrzebują do prawidłowego funkcjonowania)
krótsze fragmenty DNA
DNA przeciskajÄ…c
przemieszczają się w żelu
"B" kwas borowy szybciej niż dłuższe
się przez pory żelu
agarozowego,
"A" kwas octowy, zapewniają odpowiednie stężenie jonów
rozdziela siÄ™ pod
względem
katoda anoda
wielkości i ładunku
35 36
6
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Kwasy nukleinoweKwasy nukleinowe 214 kwasy karboksylowe materiały dodatkoweZwiązki heterocykliczne i kwasy nukleinowecw 11 kwasy nukleinoweBW13 KWASY NUKLEINOWEkwasy nukleinowe 2Kwasy nukleinowekwasy nukleinowekwasy nukleinowe wyklad inauguracyjnykwasy nukleinowe i enzymykwasy nukleinowenukleotydy i kwasy nukleinoweKwasy nukleinowe (2)Kwasy nukleinowe wykładwięcej podobnych podstron