ANALIZA
INSTRUMENTALNA
21.
Instrumentalna analiza chemiczna powstała dzięki konstruowaniu precyzyj-
nych aparatów pomiarowych, które pozwalają wykorzystać własności fizykoche-
miczne związków do ich analizy jakościowo-ilościowej. Spośród ró\nych technik
analizy instrumentalnej omówiono tylko niektóre, podstawowe z zakresu technik
optycznych, elektrycznych i chromatograficznych.
ABSORPCJOMETRIA
Iwona śak, Beata Sarecka
Absorpcjometria jest analitycznÄ… technikÄ… optycznÄ…, wykorzystujÄ…cÄ… zdol-
ność substancji chemicznych będących w roztworze do pochłaniania światła całą
swą objętością oraz pomiar natę\enia wiązki światła. Cząsteczki związków zdol-
nych do absorpcji promieniowania świetlnego są układami rezonansowymi, zdol-
nymi do drgań z częstotliwością zgodną z częstotliwością drgań fal elektromagne-
tycznych o określonej długości fali. Ró\ne substancje pochłaniają promieniowanie
zwykle o odmiennej długości fali, jeśli jednak pochłaniają fale tej samej długości,
to z ró\ną intensywnością.
Substancje mogą pochłaniać promieniowanie elektromagnetyczne w zakre-
sie światła widzialnego (VIS od ang. visible), tzn. o długości od 400 do 750 nm
(zakres kolorymetrii), lub nadfioletu (UV od ang. ultra violet), tzn. o długości od
200 do 400 nm, czy te\ podczerwieni (IR od ang. infra red), obejmujÄ…cej obszar
powy\ej 750 nm: podczerwień bliska zakres długości fal 750 2500 nm; pod-
czerwieÅ„ 2,5 25 µm.; podczerwieÅ„ daleka powy\ej 25 µm do uÅ‚amków mili-
metra. Promieniowanie o długości fal 0,4 200 nm to daleki nadfiolet, który charak-
teryzuje się tym, \e jest pochłaniany przez atomy tlenu, dlatego analizy w spektro-
fotometrze z tym zakresem wykonuje się po usunięciu z niego powietrza, czyli w
pró\ni.
yródłem promieniowania mogą być lampy spektralne (np. deuterowe, wodo-
rowe, rtęciowe, sodowe), lasery lub lampy \arowe. Lampy spektralne i lasery dają
353
widmo liniowe, natomiast lampy \arowe widmo ciągłe. W celu otrzymania okre-
ślonej długości fali u\ywa się odpowiednich monochromatorów. W monochroma-
torze znajduje się układ (pryzmat, siatka dyfrakcyjna lub filtry), który przez odpo-
wiednie ustawienie na szczelinę wyjściową pozwala skierować wiązkę promienio-
wania o \ądanej długości fali. Ze szczeliny wyjściowej wiązka monochromatyczna
wpada do pomieszczenia pomiarowego, w którym przechodzi przez odpowiednie
naczynie (kuwetÄ™) z roztworem zawierajÄ…cym analizowany zwiÄ…zek.
Kuwety powinny być wykonane z materiału przezroczystego dla określo-
nych długości fal. Najpowszechniejszym materiałem przezroczystym jest kwarc,
stosowany dla fal o długości: 200 400 nm, 400 750 nm oraz 750 2500 nm. Poza
tym, dla fal o długości 400 750 nm stosuje się równie\ wysokojakościowe szkło,
a dla dÅ‚u\szych fal podczerwieni krysztaÅ‚y: NaCl (w zakresie 2,5 15 µm), KBr (do
25 µm), CsBr (w zakresie 25 40 µm) i specjalne gatunki polietylenu przezroczy-
stego dla fal o dÅ‚ugoÅ›ci w granicach 15 300 µm.
PodstawÄ™ kolorymetrycznego oznaczania stÄ™\enia substancji w roztworze
stanowi zale\ność między intensywnością zabarwienia roztworu, a stę\eniem za-
wartej w nim substancji. Metoda ta słu\y do oznaczania stę\enia substancji mają-
cych własną barwę. Barwa substancji zale\y od selektywnej absorpcji określonej
długości światła widzialnego i jest barwą dopełniającą do pochłoniętej. Na zabar-
wienie roztworu składają się fale elektromagnetyczne nie zaabsorbowane przez
analizowaną substancję, czyli promieniowanie przepuszczone. Przykładowo, czer-
wona barwa roztworu substancji mo\e być wynikiem pochłaniania zieleni, która
jest barwą dopełniającą do czerwieni lub zdolności analizowanej substancji do
przepuszczania wyłącznie promieniowania czerwonego. Podobnie \ółta barwa roz-
tworu substancji mo\e być wynikiem pochłaniania fal niebieskich, które są barwą
dopełniającą do \ółtej lub zdolności analizowanej substancji do przepuszczania
wyłącznie promieniowania \ółtego.
Roztwory substancji bezbarwnych to takie, w których \aden z rodzajów
promieni widzialnych nie ulega pochłonięciu.
Substancje bezbarwne mo\na oznaczać ilościowo metodą kolorymetyczną,
lecz po przeprowadzeniu ich w barwne pochodne na drodze stechiometrycznych
reakcji chemicznych, które powinny przebiegać szybko i do końca, powinny być
powtarzalne i specyficzne oraz łatwe do przeprowadzenia. Specyficzność reakcji
zwykle określa u\yty odczynnik barwiący, który powinien reagować tylko z bada-
ną substancją i nie powinien wchodzić w reakcję z \adną inną substancją obecną
w roztworze. Powstała barwa powinna być: trwała, niewra\liwa na światło, niepo-
datna na zmiany pH, niezale\na od zmian temperatury i nadmiaru odczynnika bar-
wiÄ…cego.
Efekty absorpcji w zakresie światła widzialnego i ultrafioletu obserwuje się
w widmach związków zawierających grupy chromoforowe oraz ugrupowania
354
atomów z wielokrotnymi sprzę\onymi wiązaniami nienasyconymi. Niektóre z nich
przykładowo przedstawiono poni\ej.
\ \ /
C O C C N O N N
/ / \
\ \
C N C C C S
/ /
Na intensywność barwy związku wpływają równie\ podstawniki, zwane
grupami auksochromowymi, które przykładowo przedstawiono poni\ej. Mają
one zdolność przesuwania maksimum absorpcji w kierunku fal dłu\szych, zjawisko
to zwane jest efektem batochromowym.
CH3, NH2, OH, OCH3, SH, Cl, Br
AbsorpcjÄ™ promieniowania przez roztwory opisuje prawo Beera. NatÄ™\enie
(Io) wiązki promieniowania, którą przepuści się przez warstwę roztworu substancji
pochłaniającej światło, spada do wartości (I), gdy przejdzie przez roztwór. Stosu-
nek I do Io nazywa się transmitancją (T) lub przepuszczalnością, wyra\aną zwy-
kle w procentach promieniowania przechodzącego przez analizowany roztwór:
I I
T = T% = Å"100
I0 I0
Transmitancja mo\e przyjmować wartości od 0 do 100. Wartość T będzie
największa (100% przepuszczalności światła), gdy nie będzie absorpcji światła
przez roztwór, najmniejsza wartość T (0% przepuszczalności światła) oznacza
całkowitą absorpcję promieniowania.
Transmitancja nie jest prostoliniową funkcją stę\enia substancji pochłaniają-
cej światło w przeciwieństwie do absorbancji (A), innej wielkości pozwalającej
ocenić spadek natę\enia wiązki światła po przejściu przez warstwę roztworu sub-
stancji pochłaniającej światło. Absorbancja to logarytm odwrotności transmitancji:
1 I0
A = log = log = µÅ"cÅ"1
T I
gdzie:
µ współczynnik absorpcji; c stÄ™\enie roztworu; l grubość warstwy roztworu absorbu-
jÄ…cego w cm.
355
Absorbancja (A), zwana te\ ekstynkcją (E) lub gęstością optyczną (D),
równa się logarytmowi stosunku natę\enia promieniowania padającego (Io) do
natÄ™\enia promieniowania przepuszczonego (I).
Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stanowi podstawowe prawo absorpcjo-
metrii, zgodnie z którym absorbancja substancji pochłaniającej światło jest wprost
proporcjonalna do stę\enia i grubości warstwy roztworu, którego matematyczny
zapis to: A = µÅ" Å"l. JeÅ›li stÄ™\enie roztworu (mol/l) i grubość jego warstwy (w cm) sÄ…
Å"cÅ"
Å" Å"
Å" Å"
równe jednoÅ›ci, to wówczas współczynnik absorpcji (µ) równa siÄ™ wartoÅ›ci mie-
rzonej absorbancji, A = µ, dlatego nazywa siÄ™ molowym współczynnikiem ab-
sorpcji. Dla bardzo wielu substancji bezpośredni pomiar A przy stę\eniu 1 mol/l
jest niemo\liwy, dlatego wartość molowego współczynnika absorpcji oblicza się
z pomiaru absorbancji przy stę\eniu znacznie ni\szym, korzystając z zale\ności:
A A
µ = l / molÅ"cm to c =
cÅ"l µ
l/mol Å"cm
Je\eli stę\enie substancji pochłaniającej promieniowanie jest wyra\one
w gramach na litr, wówczas współczynnik nosi nazwę właściwego współczynnika
absorpcji (Ä…
ą). Molowy współczynnik absorpcji zale\y od długości fali, temperatu-
Ä…
Ä…
ry i u\ytego rozpuszczalnika. Im większą wartość ma molowy współczynnik
absorpcji danej substancji, tym mniejszą ilość tej substancji mo\na oznaczyć kolo-
rymetrycznie.
Znając wartość molowego współczynnika absorpcji analizowanej substancji
i absorbancję roztworu o nieznanym stę\eniu tej substancji mo\na obliczyć jej
stÄ™\enie (wyra\one w mol/l) na podstawie matematycznego zapisu prawa Bougu-
era-Lamberta-Beera, jednak obliczenia takie stosuje siÄ™ rzadko, zwykle odczytuje
siÄ™ je ze sporzÄ…dzonego wykresu kalibracyjnego.
W celu stwierdzenia, czy dana substancja pochłania promieniowanie w da-
nym zakresie długości fal, nale\y dokonać pomiarów absorbancji dla ka\dej długo-
ści fali z tego zakresu. Z otrzymanych pomiarów sporządza się wykres zale\ności
absorbancji od długości fali, który jest charakterystycznym dla danej substancji
widmem absorpcyjnym, w danym zakresie długości fal. Na widmie znajduje się
maksymalna wartość absorbancji dla określonej długości fali, przy której następnie
dokonuje się pomiarów absorbancji roztworów wzorcowych i badanych danej sub-
stancji. Je\eli substancja nie pochłania światła w danym zakresie długości fal, war-
tości absorbancji są równe lub bliskie zeru.
Największą zaletą absorbancji jest jej wprost proporcjonalna zale\ność od
stę\enia. Wykres tej zale\ności w dostatecznie szerokim zakresie ma kształt krzy-
wej logarytmicznej. W początkowym odcinku ka\dej pojedynczej wartości absor-
bancji mo\na przyporządkować tylko jedną wartość stę\enia. W miarę, jak wykres
356
staje siÄ™ asymptotÄ… krzywej, niemo\liwe okazuje siÄ™ przyporzÄ…dkowanie pojedyn-
czej wartości absorbancji tylko jednego stę\enia, bo w miarę postępu krzywej,
jednej wartości absorbancji mo\na przyporządkować nieskończenie wiele stę\eń.
3
1
2
STśENIE
Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stosuje siÄ™ tylko do poczÄ…tkowego odcinka
wykresu zale\ności absorbancji do stę\enia. Jest on prostoliniowy i nazywa się
wykresem kalibracyjnym (1), z którego mo\na odczytać szukane stę\enie roz-
tworu po zmierzeniu wartości jego absorbancji. W wykresie kalibracyjnym mogą
zdarzać się odchylenia od prostoliniowej zale\ności, mianowicie: ujemne (2)
gdy absorbancja zwiększa się wolniej wraz ze zwiększaniem stę\enia, ni\ wyni-
kałoby to z proporcjonalnej zale\ności, lub dodatnie (3) gdy absorbancja zwięk-
sza się znaczniej wraz ze zwiększaniem stę\enia, ni\ wynikałoby to z proporcjo-
nalnej zale\ności. Przyczynami odchyleń od prawa Lamberta-Beera mogą być
takie zjawiska, jak: dimeryzacja, dysocjacja lub asocjacja, które mogą wpływać na
własności optyczne substancji oraz zale\ą od stę\enia. Wykres kalibracyjny wyko-
rzystuje się w zakresie prostoliniowej zale\ności.
Ponadto, stę\enie substancji, spełniającej prawo Bouguera-Lamberta-Beera
w zakresie stę\eń, dla których zale\ność absorbancji od stę\enia jest prostoliniowa,
mo\na oznaczyć bez sporządzania wykresu kalibracyjnego. W tym celu mierzy się
wartość absorbancji roztworu analizowanej substancji o znanym stę\eniu (wzo-
rzec) oraz roztworu analizowanego o nieznanym stÄ™\eniu. StÄ™\enie oznaczane
oblicza się po przekształceniu następującej proporcji:
Aw : Ax = cw : cx cx = cw Å" Ax / Aw
gdzie:
Aw absorbancja roztworu o znanym stÄ™\eniu (wzorca); Ax absorbancja roztworu anali-
zowanego o nieznanym stÄ™\eniu; cw stÄ™\enie znane, wzorca; cx stÄ™\enie oznaczane
357
ABSORBANCJA
Aparaty słu\ące do pomiaru absorbancji to absorpcjometry. Stę\enie związ-
ków barwnych oceniano pierwotnie przez intensywność zabarwienia, czyli koloru,
stÄ…d wywodzi siÄ™ wciÄ…\ u\ywana nazwa kolorymetria, odnoszÄ…ca siÄ™ do absorp-
cjometrii w świetle widzialnym. Przyrządem słu\ącym do tego typu pomiarów jest
kolorymetr, który mo\na traktować jako uproszczony spektrofotometr.
Przyrządy stosowane do pomiaru absorpcji promieniowania mo\na najogól-
niej podzielić na:
1) fotokolorymetry w których światło monochromatyczne uzyskuje się
przez specjalne filtry świetlne;
2) spektrofotometry zawierajÄ…ce pryzmaty lub siatki dyfrakcyjne do uzy-
skiwania monochromatyzacji światła.
Na ogólny schemat budowy tych aparatów składa się: a) zródło światła, b)
regulator natÄ™\enia wiÄ…zki promieniowania, c) monochromatory, d) pojemnik na
roztwór badany, e) detektor, f) wskaznik pomiaru.
Przy pomiarze absorbancji pierwszą czynnością, jaką nale\y wykonać jest
nastawienie aparatu na wymaganą długość fali. Następnie trzeba przepuścić wiązkę
światła monochromatycznego (przy ustawieniu wskaznika cyfrowego na 100%
przepuszczalności) przez kuwetę zawierającą roztwór porównawczy (np. woda lub
u\ywany rozpuszczalnik) bądz tzw. próbę ślepą (jest to roztwór o takim samym
składzie i pH, jak roztwór badany, nie zawierający jednak oznaczanego składnika).
Jest to podstawowa zasada oznaczeń absorpcjometrycznych, pozwalająca na wy-
eliminowanie wpływu odczynników i zawartych w nich zanieczyszczeń na osta-
teczny wynik pomiaru. Kolejny etap to przełączenie wskaznika cyfrowego na
absorbancję, która powinna wynosić 0,00. Dopiero po wyzerowaniu aparatu na
próbie ślepej mo\na odczytać absorbancję roztworu badanego, umieszczonego
w identycznej kuwecie.
Metody kolorytmetryczne nale\ą do najłatwiejszych i najszybszych metod
analitycznych, są uniwersalne, dokładne i czułe.
POLARYMETRIA
Iwona śak, Izabela Szołtysek-Bołdys
Polarymetria to technika analityczna, która wykorzystuje zjawisko skręcania
płaszczyzny światła spolaryzowanego do wykrywania lub oznaczania stę\enia
substancji optycznie czynnej, m.in. w analizie środków leczniczych. Przyrządem
słu\ącym do oznaczania kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego jest
polarymetr. Wiązkę światła liniowo spolaryzowanego otrzymuje się po przepusz-
358
czeniu wiązki światła monochromatycznego (lampy sodowej) przez pryzmat Ni-
cola (nikol).
Pryzmat Nicola to dwułomny kryształ szpatu islandzkiego (krystaliczny
CaCO3), który szlifuje siÄ™ pod kÄ…tem 68°, przecina wzdÅ‚u\ przekÄ…tnej, po czym
obie połówki skleja balsamem kanadyjskim o współczynniku załamania równym
1,54; główny przekrój jest płaszczyzną polaryzacji pryzmatu.
balsam kanadyjski
68
90
promień nadzwyczajny
promień zwyczajny
Schemat działania pryzmatu Nicola
Wchodzący do pryzmatu Nicola promień światła rozszczepia się na dwa
promienie: zwyczajny i nadzwyczajny. Promień zwyczajny pada na warstwę bal-
samu kanadyjskiego pod kątem większym od granicznego, dlatego ulega odbiciu
i wygaszeniu, promień nadzwyczajny zaś pod kątem mniejszym od granicznego,
dlatego przechodzi bez zmian.
Spolaryzowane promienie nadzwyczajne po opuszczeniu pryzmatu Nicola
biegnÄ… dalej w tym samym kierunku, co promienie padajÄ…ce na ten pryzmat. Zatem
pryzmat Nicola przepuszcza drgania fali elektromagnetycznej tylko w jednej płasz-
czyznie, natomiast wygasza drgania w innych płaszczyznach.
Po przepuszczeniu światła monochromatycznego przez dwa pryzmaty Nico-
la, ustawione jeden za drugim, natę\enie światła spolaryzowanego zale\y od usta-
wienia drugiego.
Światło spolaryzowane wykazuje maksymalne natę\enie, gdy płaszczyzny
polaryzacji obu pryzmatów Nicola są do siebie ustawione równolegle. W przypad-
ku, gdy jeden zostanie obrócony wokół swej osi mo\na obserwować coraz większe
zaciemnienie w polu widzenia, tj. wygaszanie światła wychodzącego z polarymetru.
Maksymalne zaciemnienie, czyli wygaszenie światła ma miejsce, gdy kąt
obrotu pryzmatu Nicola osiÄ…gnie 90°, wówczas pÅ‚aszczyzny polaryzacji (główne
przekroje) obu pryzmatów są do siebie prostopadłe (skrzy\owane). W takim uło\e-
359
niu drugi pryzmat Nicola nie przepuszcza wiązki światła spolaryzowanego wycho-
dzÄ…cego z pierwszego. WiÄ…zka odbija siÄ™ od warstwy balsamu w drugim pryzmacie
i dalej biegnie jako wiÄ…zka promieni zwyczajnych.
Schemat budowy polarymetru
1 2 3 4 5 6 7 8
gdzie:
1 zródło światła; 2 filtr \ółty dający światło monochromatyczne; 3 soczewka dająca
wiązkę promieni równoległych; 4 polaryzator; 5 płytka kwarcowa; 6 rurka polaryme-
tru; 7 analizator; 8 okular
W polarymetrach pierwszy pryzmat Nicola jest nieruchomy i nosi nazwÄ™ po-
laryzatora, poniewa\ słu\y do wytwarzania wiązki światła spolaryzowanego.
Drugi to analizator, który jest ruchomy wokół osi optycznej i sprzę\ony ze skalą
kątową, słu\ącą do odczytu wielkości kąta skręcenia.
Zasada działania polarymetru opiera się na tym, \e jeśli między pryzmatami
Nicola (skrzy\owane) umieści się substancję optycznie czynną, która skręca płasz-
czyznę światła spolaryzowanego o kąt ą, to pole widzenia w okularze rozjaśni się
proporcjonalnie do stÄ™\enia tego zwiÄ…zku.
W celu osiągnięcia pierwotnego zaciemnienia nale\y obrócić analizator do-
kładnie o kąt ą. W przypadku jednych związków optycznie czynnych, analizator
nale\y obrócić w prawo (substancje prawoskrętne), w przypadku drugich w lewo
(substancje lewoskrętne). Kąt skręcenia odczytuje się na skali kątowej z dokładno-
Å›ciÄ… do 0,05° za pomocÄ… noniusza.
Najczęściej u\ywane są polarymetry półcieniowe: dwucieniowe (dwupolo-
we) lub trójcieniowe (trójpolowe), które umo\liwiają porównanie natę\enia światła
opuszczającego polaryzator z natę\eniem światła przechodzącego przez analizator.
W polarymetrach tych część wiązki światła przepuszcza się przez dodatkowy pry-
zmat lub płytkę kwarcową, które rozdzielają pole widzenia w okularze. Dzięki
temu w okularze mo\e ukazać się jednocześnie pole maksymalnie jasne obok pola
ciemniejszego.
Polarymetr jest tak uregulowany, \e jeśli w rurce polarymetru nie ma sub-
stancji optycznie czynnej i zerowa kreska podziałki kątowej pokrywa się z zerową
kreską podziałki noniusza, wtedy wszystkie części pola widzenia w okularze są
jednolicie szaro oświetlone (wygaszone), tak jak w pozycji b na rysunku, przed-
stawiającym rodzaje pól widzenia w polarymetrze.
360
Jeśli w rurce polarymetrycznej umieści się substancję optycznie czynną le-
woskrętną, wówczas pojawi się pasek jasny w środkowej części pola widzenia,
któremu towarzyszą po bokach pola ciemne, tak jak w pozycji a na rysunku.
Rodzaje pól widzenia w polarymetrze
a b c
lewoskrętna wygaszenie całkowite prawoskrętna
substancja substancja
Je\eli w rurce polarymetrycznej umieści się substancję prawoskrętną, wów-
czas pojawia się pasek ciemny w środkowej części pola widzenia, któremu towa-
rzyszÄ… po bokach pola jasne, tak jak w pozycji c na rysunku.
Podstawą polarymetrii jest zale\ność wyra\ona wzorem:
Ä… = [Ä…]D Å" c Å" l
gdzie:
ą zmierzony kąt skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego; [ą]D skręcalność
właściwa; c stę\enie związku optycznie czynnego, w g/ml roztworu; l grubość warstwy
roztworu, przez którą przechodzi wiązka światła spolaryzowanego, w dm
Wartość mierzonego kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego
przez związek optycznie czynny zale\y od stę\enia substancji, od grubości war-
stwy roztworu tej substancji, przez którą przechodzi światło spolaryzowane oraz od
rodzaju substancji, jej budowy, ilości i rozmieszczenia jej centrów chiralności.
Daną substancję optycznie czynną charakteryzuje wartość skręcalności właściwej.
Skręcalność właściwa danej substancji to kąt, o jaki skręcałaby płaszczyznę
światła spolaryzowanego jednodecymetrowa warstwa roztworu danej substancji
o stę\eniu 1g/ml. Jej wartość zale\y od długości fali promieni spolaryzowanych,
temperatury i rodzaju rozpuszczalnika, dlatego przy zapisie wartości skręcalności
właściwej podaje się te parametry:
361
Ä…
20
Ä… =
D
c(g / ml)Å"l(dm)
gdzie:
[ą]D20 skręcalność właściwa rozpuszczonej substancji wyra\ona w stopniach; indeks
górny 20 oznacza temperaturę pomiaru; indeks dolny D światło monochromatyczne, czyli
linia D lampy sodowej (589,3 nm); ą zmierzony kąt skręcenia płaszczyzny światła spola-
ryzowanego wyra\ony w stopniach; c stę\enie roztworu wyra\one w g/ml; l grubość
warstwy roztworu, wyra\ona w dm, przez którą przechodzi światło spolaryzowane.
Po dokonaniu pomiaru kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego
przez substancję o znanej wartości skręcalności właściwej mo\na określić jej stę-
\enie, wyra\one w g/ml, na podstawie matematycznej zale\ności:
Ä…
c =
20
Ä… Å"l (dm)
D
W technice polarymetrii stę\enie wyznacza się z pomiaru kąta skręcenia na
podstawie prostej matematycznej zale\ności, której warunki stosowania mo\na
łatwo zapewnić. Związek między stę\eniem a odpowiadającym mu kątem skręce-
nia wyznacza wartość skręcalności właściwej, którą odczytać mo\na z odpowied-
nich zestawień tabelarycznych w poradnikach fizykochemicznych.
Iloczyn skręcalności właściwej i masy molowej (M) podzielony przez 100
określa się jako skręcalność molowa [Ś]:
Ä… Å" M
F =
100
Pozwala ona na porównywanie zdolności do skręcania światła spolaryzowa-
nego w skali molowej. Poniewa\ wartość iloczynu skręcalności właściwej i masy
molowej byłaby liczbą zbyt du\ą, niewygodną w u\yciu, została podzielona przez
100.
CHROMATOGRAFIA
Iwona śak
Chromatografia jest metodą słu\ącą do rozdzielania mieszanin substancji,
w której wykorzystywane są ró\ne fizykochemiczne oddziaływania rozdzielanych
substancji z dwoma fazami: ruchomą i nieruchomą. Fazą nieruchomą mo\e być
362
ciało stałe (w chromatografii adsorpcyjnej) lub ciecz, unieruchomiona w stałym
nośniku (w chromatografii podziałowej), fazą ruchomą bywa ciecz lub gaz.
Chromatografia adsorpcyjna
W chromatografii adsorpcyjnej wykorzystuje się zjawisko adsorpcji, które
jest następstwem cząsteczkowych oddziaływań dyspersyjnych, tworzenia się sła-
bych wiązań chemicznych, wodorowych, doprowadzających do nagromadzania się
substancji rozpuszczonej na powierzchni ciała stałego, zwanego adsorbentem.
Wielkość adsorpcji określa się stosunkiem ilości masy substancji zaadsorbowanej,
zwanej adsorbatem, przypadającej na jednostkę masy adsorbenta. Wielkość ta za-
le\y od temperatury oraz rodzaju adsorbatu i adsorbenta. Adsorbentami mogą być:
\el skrobiowy, sacharoza, węglan wapniowy, fosforan wapniowy, fosforan magne-
zowy, tlenek magnezowy, \el krzemionkowy, węgiel aktywny i inne. Adsorbenty
mo\na podzielić na dwie zasadnicze grupy, tj. polarne, np. \el krzemionkowy,
i niepolarne, np. węgiel aktywny. Fazą ruchomą u\ywaną do elucji są zwykle cie-
kłe związki organiczne o ró\nych stopniach polarności, od węglowodorów po al-
kohole i kwasy organiczne. Moc elucyjną poszczególnych rozpuszczalników mo\-
na określić, wyznaczając wartość współczynnika Rf (rate of flow szybkość prze-
pływu) dla substancji testowanej, zachowując jednakowe warunki doświadczalne
(te same: adsorbent, adsorbat i temperatura).
DROGA PRZEBYTA PRZEZ SUBSTANCJ
Rf =
DROGA PRZEBYTA PRZEZ ROZPUSZCZALNIK
Rf jest to stosunek odległości przebytej przez migrującą substancję do odle-
głości przebytej przez czoło rozpuszczalnika w tym samym czasie.
W chromatografii adsorpcyjnej rozdzielenie mieszaniny substancji odbywa
się głównie dzięki ró\nicom w ich adsorpcji przez adsorbent. Substancje słabiej
adsorbowane przez adsorbent są wymywane przez rozpuszczalnik wcześniej. Na-
tomiast silniej adsorbowane przez adsorbent pozostajÄ… z nim zwiÄ…zane. Czasami
dla ich wymycia z adsorbentu nale\y zastosować wiele rozpuszczalników o rosną-
cej mocy eluowania (zdolności wymywania) lub elucję gradientową, polegającą na
ciągłym zwiększaniu mocy rozpuszczalnika wymywającego.
Chromatografia podziałowa
W chromatografii podziałowej rozdzielenie mieszaniny opiera się na ró\nej
rozpuszczalności jej związków w dwóch nie mieszających się rozpuszczalnikach.
Jeden z rozpuszczalników, unieruchomiony na nośniku, stanowi fazę nieruchomą,
natomiast drugi przemieszcza się względem pierwszego i stanowi fazę ruchomą.
Rozdzielane substancje dzielą się pomiędzy fazę ruchomą i nieruchomą zgodnie
363
z ich rozpuszczalnością w tych fazach. Substancje, które lepiej rozpuszczają się
w fazie nieruchomej, migrują wolniej i to właśnie prowadzi do rozdziału. Na pod-
stawie polarności poszczególnych faz wyró\niamy:
Ò! chromatografiÄ™ podziaÅ‚owÄ… zwykÅ‚Ä…, w której fazÄ… nieruchomÄ… jest woda (lub
roztwór buforowy albo rozpuszczalnik organiczny nasycony wodą) osadzona na
nieaktywnym nośniku (np. bibuła), a fazą ruchomą jest rozpuszczalnik orga-
niczny;
Ò! chromatografiÄ™ podziaÅ‚owÄ… z fazÄ… nieruchomÄ…, mniej polarnÄ… od wody, np. hy-
drofilny rozpuszczalnik organiczny nie mieszajÄ…cy siÄ™ z fazÄ… ruchomÄ…;
Ò! chromatografiÄ™ podziaÅ‚owÄ… z odwróconymi fazami, w której noÅ›nik jest silnie
hydrofobowy i utrzymuje nieruchomą fazę organiczną. Zró\nicowanie szybko-
ści wędrowania składników rozdzielanej mieszaniny wynika z ró\nych wartości
współczynników podziału dla poszczególnych składników.
Współczynnik podziału substancji (k) jest to stosunek stę\enia substancji
rozpuszczonej w fazie ruchomej do jej stę\enia w fazie nieruchomej, który w stanie
równowagi i w danej temperaturze ma wielkość stałą.
STśENIE W FAZIE RUCHOWEJ
k =
STśENIE W FAZIE NIERUCHOMEJ
Najszybciej wędrują składniki posiadające największą wartość współczynni-
ka podziału. Podczas chromatografii podziałowej, poza podziałem składników
między dwie fazy ciekłe, często mają miejsce zjawiska związane w mniejszym lub
większym stopniu z adsorpcją składników z nośnikiem. Siły adsorpcji hamują ruch
podczas procesu chromatograficznego.
Rozdzielane substancje w danych warunkach chromatograficznych charak-
teryzuje ró\na szybkość wędrowania, określona współczynnikiem Rf.
Substancje, które mają identyczne wartości współczynników Rf, nie mogą
być rozdzielone w danych warunkach chromatograficznych.
Jeśli substancja ma współczynnik szybkości przepływu Rf = 1, to oznacza,
\e wędruje ona wraz z czołem rozpuszczalnika, czyli jest bardzo dobrze rozpusz-
czalna w fazie ruchomej, a nierozpuszczalna w fazie nieruchomej.
Je\eli natomiast substancja ma wartość Rf = 0, to oznacza, \e substancja ta
jest na tyle słabo rozpuszczalna w fazie ruchomej, \e pozostała na linii startowej,
nie będąc w stanie migrować.
W chromatografii podziałowej najczęściej stosowanymi technikami są chro-
matografie: bibułowa, kolumnowa i cienkowarstwowa.
W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy nieruchomej jest bibuła, w któ-
rej kierunek włókien celulozowych mo\e czasami mieć niekorzystny wpływ na
zdolność rozdzielczą tego nośnika.
364
W chromatografii kolumnowej lub cienkowarstwowej nośnikami są \ele
krzemionkowe, celulozowe, ziemia okrzemkowa i inne obojętne, porowate mate-
riały, które albo wypełniają kolumny, albo naniesione są w postaci cienkiej war-
stwy na płytkach szklanych lub plastikowych. Wymienione nośniki są hydrofilowe,
dlatego faza na nich unieruchomiona jest zawsze polarna, najczęściej woda lub
wodne roztwory metanolu, kwasu octowego, buforów i inne. Jako faz ruchomych
u\ywa się rozpuszczalników organicznych lub ich mieszanin, niekiedy z dodatkiem
polarnych substancji, np. kwasu octowego. Nośniki o charakterze hydrofobowym
(np. celulozy acetylowane lub kauczuk w obecności benzenu lub chloroformu)
wykorzystuje się w chromatografii podziałowej z odwróconymi fazami, gdzie sto-
suje siÄ™ niepolarnÄ… fazÄ™ nieruchomÄ….
W chromatografii kolumnowej na pionowo ustawioną kolumnę, wypełnioną
nośnikiem zrównowa\onym fazą nieruchomą, nanosi się roztwór mieszaniny prze-
znaczonej do rozdzielenia, który wnika w kolumnę. Składniki mieszaniny, głównie
dzięki ró\nym współczynnikom podziału, wędrują z ró\ną prędkością wraz z fazą
ruchomą. Wymywane z kolumny poszczególne składniki mieszaniny zbierane są
do probówek znajdujących się w kolektorze frakcji, automatycznie przesuwającym
probówki, zale\nie od nastawionego przedziału czasowego lub objętości zbieranej
frakcji.
W chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej wyró\niamy dwie podsta-
wowe techniki: chromatografię wstępującą i zstępującą. W tej pierwszej faza ru-
choma wraz z rozdzielanymi substancjami wędrują wskutek sił kapilarnych war-
stwy nośnika. W technice zstępującej faza ruchoma wraz z rozdzielanymi substan-
cjami wędrują wskutek sił cię\kości.
Po zakończeniu migracji na chromatogramie nale\y uwidocznić i zidentyfi-
kować rozdzielone związki, jeśli nie są one barwne. Właściwe u\ycie wzorców,
odpowiednich odczynników identyfikujących i metod fizykochemicznych wraz
z pomiarem wartości Rf pozwala na rozpoznanie substancji tworzących plamki na
chromatogramie. Sposób wywołania chromatogramu zale\y od celu danej analizy.
Chromatografia na sitach molekularnych
W chromatografii na sitach molekularnych, zwanej sÄ…czeniem molekular-
nym lub filtracjÄ… \elowÄ…, rozdzielanie mieszaniny czÄ…steczek odbywa siÄ™ na pod-
stawie ich wielkości i kształtu.
Nośnikami fazy ruchomej, czyli sitami molekularnymi w tej metodzie, są
usieciowane poprzecznie, nierozpuszczalne polimery węglowodanowe, typu dek-
stran (Sephadex) lub agaroza (Sepharose), oraz polimery poliakrylamidowe (Bio-
Gel). Są one wysoce uwodnionymi ziarnami o strukturze porowatej, których wiel-
kość porów jest charakterystyczna dla danego rodzaju sita, a poszczególne rodzaje
sit ró\nią się rozmiarami porów. Wielkość porów określa rozmiar kanalików
365
w ziarnach, np. im będą one większe, tym większe cząsteczki będą do nich wnika-
ły. Przykładowo, zdolności rozdzielcze Sephadexów serii G (G-15 G-200) są
ró\ne, np. na Sephadexie G-75 najlepiej rozdzielane są substancje o masach czą-
steczkowych mieszczÄ…cych siÄ™ w zakresie 3000 150 000, a np. na Sephadexie
G-200 o masach w zakresie 5000 800 000.
Techniki z u\yciem sit molekularnych sÄ… podobne do stosowanych w przy-
padku chromatografii podziałowej, mianowicie technika kolumnowa lub cienko-
warstwowa. W obu przypadkach, zasada rozdzielania polega na tym, \e czÄ…steczki
mniejsze od wielkości porów wchodzą do kanalików w poszczególnych ziarnach
sit, natomiast cząsteczki od nich większe lub o wydłu\onym kształcie nie mogą
wejść do wnętrza kanalików w ziarnach. Cząsteczki większe występują tylko
w płynie otaczającym ziarna, mają więc krótszą drogę do przebycia, ni\ cząsteczki
mniejsze, które znajdują się w płynie o większej objętości (jest to płyn otaczający
porowate ziarna, jak i wypełniający kanaliki w ziarnach), dlatego mają dłu\szą
drogę do przebycia od cząsteczek większych. Cząsteczki większe przemieszczają
siÄ™ przez sita molekularne szybciej i ulegajÄ… elucji jako frakcje poczÄ…tkowe, nato-
miast mniejsze poruszają się znacznie wolniej, poddając się elucji jako frakcje póz-
niejsze.
Sączenie molekularne często wykorzystywane jest do odsalania roztworów
białek izolowanych z materiału biologicznego metodami wysalania. Podczas roz-
działu cząsteczki soli wnikają do kanalików ziaren i eluowane są znacznie pózniej
od frakcji białek, które nie mając mo\liwości wejścia do kanalików ziaren, szcze-
gólnie Sephadexu G-25, wcześnie wymywane są z kolumny niemal z objętością
swobodną kolumny (Vo), czyli objętością rozpuszczalnika wypełniającego prze-
strzeń między ziarnami.
Sita molekularne najczęściej stosuje się do rozdziału białek, peptydów, kwa-
sów nukleinowych i innych związków, zarówno w badaniach analitycznych, jak i
w celach preparatywnych. Sączenie molekularne mo\na tak\e wykorzystać do
wyznaczenia masy cząsteczkowej, np. białek. W tym celu nale\y wyznaczyć obję-
tość elucyjną (Ve) dla danego białka i objętość swobodną kolumny (Vo). Między
określoną względną objętością elucyjną białka (Ve/Vo) a logarytmem jego masy
cząsteczkowej występuje zale\ność liniowa. Dzięki temu, po wystandaryzowaniu
sita molekularnego wzorcowymi białkami o znanej masie cząsteczkowej, wykreśla
się krzywą wzorcową (zale\ności Ve/Vo do log10 masy cząsteczkowej), z której
mo\na odczytać masę cząsteczkową badanego białka, znając jego względną obję-
tość elucyjną.
Chromatografia jonowymienna
W metodzie tej nośnikiem są wymieniacze jonowe (jonity), wysokoczą-
steczkowe, usieciowane związki nierozpuszczalne, które posiadają łatwo dysocju-
366
jące grupy chemiczne, kwaśne lub zasadowe. W ściśle określonych warunkach (pH
i mocy jonowej roztworu) mogą one wiązać jony z roztworu oraz oddawać je
w przypadku zmiany tych warunków.
Kationity zawierają dysocjujące grupy kwaśne (obdarzone ładunkiem ujem-
nym), np. COO-H+, SO3-H+, fenolowe lub fosforanowe, które na zasadzie po-
dwójnej wymiany, przyłączają z roztworu rozdzielanej mieszaniny kationy, np.
Ca++, oddajÄ…c atom wodoru.
Anionity zawierajÄ… dysocjujÄ…ce grupy zasadowe, np. N(CH3)3+OH-, lub ak-
tywne ugrupowania amin I-, II- lub III-rzędowych (obdarzone ładunkiem dodat-
nim), które przyłączają z roztworu rozdzielanej mieszaniny aniony, np. Cl-.
W chromatografii jonowymiennej podstawą rozdziału mieszaniny cząsteczek jest
ich całkowity ładunek. Dlatego na kolumnie kationitowej z rozdzielanej mieszani-
ny zostaną zatrzymane tylko kationy, natomiast aniony i cząsteczki obojętne nie
mogą być związane, dlatego wypłyną z kolumny wraz z frontem rozpuszczalnika.
Związane z jonitem kationy mo\na następnie wymyć z kolumny przez przemycie
roztworem jonów dodatnich, np. Na+ o wzrastającym gradiencie, które konkurują
z badanymi kationami o wiÄ…zanie z obdarzonymi Å‚adunkami ujemnymi grupami
jonitu, lub te\ uwolnić je poprzez zwiększenie pH buforu elucyjnego. Miarą po-
jemności wymieniacza jest stę\enie aktywnych (obdarzonych ładunkiem) grup
wymieniacza na jednostkÄ™ masy jonitu.
W chromatografii jonowymiennej nośnikami mogą być te\ sita molekularne,
zawierajÄ…ce dodatkowo obdarzone Å‚adunkiem dodatnim grupy dietyloaminoetylo-
we (DEAE), np. DEAE-Sephadex, DEAE-celuloza, są one anionitami często wy-
korzystywanymi do rozdziału i oczyszczania białek o wypadkowym ładunku ujem-
nym (białek anionowych). Sita molekularne zawierające obdarzone ładunkiem
ujemnym grupy karboksymetylowe (CM), np. CM-Sephadex, CM-celuloza, sÄ… ka-
tionitami, często wykorzystywanymi do rozdziału i oczyszczania białek o wypad-
kowym ładunku dodatnim (białek kationowych).
Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne
i o wysokim powinowactwie wiązanie się białka z inną cząsteczką zwaną ligan-
dem, dlatego umo\liwia wyodrębnienie jednego białka z mieszaniny wielu ró\nych
białek. Przykładowo, częstymi kombinacjami specyficznych par ligandów i oczy-
szczanych białek są np.: hormon jako ligand w celu oczyszczenia rozpoznawanego
i wiÄ…\Ä…cego go specyficznie receptora; lektyna w celu oczyszczenia glikoprote-
iny; przeciwciało, aby wyizolować antygen, inhibitor do oczyszczenia enzymu.
Specyficzne ligandy są zwykle unieruchomione na porowatych nośnikach (sitach
molekularnych) na Sepharose, Sephadexie, jak np. konkanawalina A-Sephadex.
Mieszaninę białek nakłada się na immobilizowane ligandem sita molekularne,
367
uformowane na kształt zło\a wypełniającego kolumnę. Na nośniku zostanie za-
trzymane jedynie białko specyficznie wią\ące się z ligandem, natomiast wszystkie
pozostałe białka pozostaną w buforze elucyjnym, który opuści kolumnę. Białko
związane z ligandem na kolumnie mo\na uwolnić w dwojaki sposób: albo przez
przemycie kolumny roztworem zawierajÄ…cym wolnÄ… formÄ™ liganda lub poprzez
zmianÄ™ pH, czy te\ stÄ™\enia soli w buforze elucyjnym.
ELEKTROFOREZA
Iwona śak
Elektroforeza jest techniką rozdzielania związków obdarzonych ładunkiem,
która wykorzystuje zjawisko ruchu cząstek w polu elektrycznym. Pod wpływem
pola elektrycznego cząstki obdarzone ładunkiem dodatnim, czyli kationy, wędrują
do katody, tzn. elektrody ujemnej, w procesie zwanym kataforezÄ…. CzÄ…stki obda-
rzone ładunkiem ujemnym aniony wędrują w polu elektrycznym do anody, tj.
elektrody dodatniej, w procesie zwanym anaforezą. Podstawą rozdziału elektrofo-
retycznego cząstek jest ich zró\nicowana szybkość wędrówki w polu elektrycz-
nym, manifestująca się tym, \e w jednakowym czasie odmienne cząstki przewędru-
ją ró\ne odległości.
Szybkość przemieszczania cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elek-
trycznym zale\y od trzech zasadniczych grup czynników, mianowicie: 1) własno-
ści cząstek wędrujących; 2) własności środowiska, w którym cząstki wędrują; 3) od
parametrów charakteryzujących przepływający prąd.
Własności cząstek wędrujących w polu elektrycznym, które mają największy
wpływ na szybkość przemieszczania, to wielkość wypadkowego ładunku elek-
trycznego, masa i kształt cząstek. Wielkość masy i wypadkowego ładunku cząstek
działają przeciwstawnie na szybkość wędrówki. Im większy wypadkowy ładunek
cząstek, tym szybciej się poruszają, ale im większa masa, tym wolniejsza wędrów-
ka cząstek. Zatem szybkość migracji cząstek w polu elektrycznym zale\y od sto-
sunku ładunek/masa. Kształt cząstek wpływa na szybkość ich przemieszczania,
dzięki obni\aniu lub wzmaganiu oporu środowiska, który przeciwdziała ruchowi
cząstek. Opór środowiska dla cząstek o kształcie bliskim kuli (globularnym) będzie
mniejszy (dzięki czemu ruch tych cząstek jest szybszy) ni\ tych o rozpostartej kon-
formacji przestrzennej.
Środowisko, w którym cząstki wędrują, rodzaj u\ytego buforu i jego wła-
ściwości, takie jak lepkość, siła jonowa, pH i temperatura, wpływają na rozdział
elektroforetyczny. Im większa lepkość, tym większy opór środowiska ma do poko-
nania przemieszczająca się cząstka. Natomiast od siły jonowej i pH buforu elektro-
foretycznego mo\e zale\eć wielkość ładunku rozdzielanej cząstki.
368
Zastosowanie buforu o wartości pH odpowiadającej wartości pI rozdziela-
nych cząstek uniemo\liwi ich rozdział, poniewa\ w tych warunkach cząstki wystę-
pujÄ… w formie jonu obojnaczego i nie poruszajÄ… siÄ™ w polu elektrycznym. Dla czÄ…-
stek rozpuszczalnych w środowisku zasadowym najwłaściwszy będzie bufor o pH
wy\szym od pI ka\dej rozdzielanej cząstki mieszaniny. Przykładowo, bufor elek-
troforetyczny o wartości pH około 9 stwarza warunki, w których większość białek
wykazuje ujemny wypadkowy ładunek i w polu elektrycznym wędruje w kierunku
anody.
Nie bez znaczenia jest rodzaj nośnika, którego pory są wypełnione buforem
z cząstkami obdarzonymi ładunkiem elektrycznym. Nośnikiem do elektroforezy
mo\e być bibuła (ró\nego rodzaju), inny nośnik celulozowy, w tym octan celulozy
oraz obecnie powszechnie stosowane ró\ne \ele obojętne (agarozowy, poliakryla-
midowy) w przypadku elektroforezy \elowej. Bibuła jest nośnikiem o du\ej opor-
ności, natomiast \ele cechuje mała oporność oraz niska adsorpcja cząstek. Dodat-
kowo, \ele są sitami molekularnymi, w związku z tym przez kanaliki w \elu małe
cząstki przechodzą swobodnie, natomiast większe są zatrzymywane. Usieciowanie
\elu, np. poliakrylamidowego, decydujące o wielkości kanalików w \elu, mo\na
kontrolować stosownie do potrzeb przez wybór odpowiednich stę\eń akrylamidu
i odczynnika sieciujÄ…cego metylenobisakrylamidu, tworzÄ…cego wiÄ…zania poprzecz-
ne. W \elu będą tym mniejsze kanaliki, im większe zastosuje się stę\enie akryla-
midu.
Nie bez znaczenia dla rozdziału są wskazniki charakteryzujące przepływają-
cy prąd, czyli wielkość przyło\onego napięcia, a właściwie jego spadek wzdłu\
drogi wędrówki cząstek, wielkość natę\enia. Przyło\enie niskiego napięcia prądu
sprawia, \e niskie jest jego natę\enie i wydzielanie ciepła, lecz szybkość wędrówki
cząstek okazuje się wolna. W takich warunkach wydłu\a się czas potrzebny do
osiągnięcia rozdziału elektroforetycznego. Zbyt długi czas trwania rozdziału mo\e
być niepo\ądany ze względu na towarzyszące niekorzystne procesy, m.in. dyfuzję,
która powoduje rozmycie brzegów rozdzielonych stref. Pod względem wielkości
przyło\onego napięcia rozró\nia się elektroforezę niskonapięciową, w której spa-
dek napięcia wynosi do kilkunastu V/cm, oraz elektroforezę wysokonapięciową
przy spadku napięcia rzędu 50 V/cm i więcej.
Elektroforeza w \elu poliakrylamidowym (PAGE) charakteryzuje siÄ™
szczególnie du\ą rozdzielczością, która w połączeniu z wysoką czułością metod
detekcji rozdzielanych substancji pozwala na analizowanie mikrogramowych ilości
rozdzielanych mieszanin. Powszechnie stosuje siÄ™ jÄ… do rozdzielania i oczyszczania
białek oraz kwasów nukleinowych. Elektroforezę na \elu poliakrylamidowym
w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS) (PAGE-SDS) wykorzystuje się do
wyznaczania masy cząsteczkowej białek. W metodzie tej stosuje się białka, wcze-
Å›niej poddane denaturacji termicznej (100°C) w obecnoÅ›ci SDS i redukcji poprzez
dziaÅ‚anie ²-merkaptoetanolu w celu zerwania wiÄ…zaÅ„ disiarczkowych. Efektem
369
tych działań jest całkowite rozwinięcie struktury białka. Cząsteczki anionowego
detergentu SDS są silnie ujemne i opłaszczają zdenaturowane białko, tworząc wy-
dłu\one micelle, we wnętrzu których znajduje się cząsteczka białka.
W warunkach tych wszystkie białka wykazują wypadkowy ładunek ujemny
i identyczny stosunek ładunku do masy. W obecności SDS wszystkie białka posia-
dają podobny włókienkowy kształt prętopodobny i ich długość jest wówczas
proporcjonalna do długości łańcucha polipeptydowego, tym samym do masy czą-
steczkowej białka. Podczas PAGE-SDS podstawę rozdziału stanowi jedynie ró\ni-
ca wielkości mas cząsteczkowych rozdzielanych białek.
Wariantem elektroforezy na \elu poliakrylamidowym jest ogniskowanie
izoelektryczne, czyli elektroforeza PAGE w gradiencie pH, utworzonym przez
poliamfolity pod wpływem pola elektrycznego. W tych warunkach rozdział elek-
troforetyczny białek polega na tym, \e ka\de białko wędruje w polu elektrycznym
tylko do tych miejsc \elu, w których środowisko pod względem pH odpowiada
wartości jego punktu izoelektrycznego i w tych miejscach zatrzymuje się w postaci
wÄ…skiego prÄ…\ka.
Uwidocznienie w \elu rozdzielonych czÄ…stek polega na wykonaniu specy-
ficznych reakcji barwienia, charakterystycznych dla tych związków. Często białka
wybarwia siÄ™ barwnikiem Coomassie brillant blue a kwasy nukleinowe bromkiem
etydyny lub azotanem srebra.
370
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
(21 Potencjał zakłócający i anomalie)980928 21173 21 (10)2 21 SPAWANIE MIEDZI I STOPÓW MIEDZI (v4 )USTAWA z dnia 21 marca 1985 r o drogach publicznychcommercial howto 21Nyx Password Storage 1 21 readme21 (206)więcej podobnych podstron