Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metodą microarray . . .
77
IMMUNOLOGIA KLINICZNA
Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85
Badanie ekspresji genów metodą microarray
perspektywy wykorzystania w medycynie
AnaIysis of gene expression with microarrays appIication
in medicine
RAFAŁ PAWLICZAK 1, 2/, MAREK L. KOWALSKI 1/
1/
Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej AM w Łodzi, ul. Pomorska 251, 92-213 Łódx
2/
Critical Care Medicine Department, Warren Grant Magnuson Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA
Ostatnia dekada przyniosła burzliwy rozwój technologii badania Microarrays are one of the latest breakthroughs in experimental
ekspresji genów. Technologia odwrotnej transkrypcji połączona molecular biology, which allow monitoring of gene expression for tens
z reakcją łańcuchową polimerazy monitorowanej komputerowo of thousands of genes in parallel and are already producing huge amounts
w czasie rzeczywistym umożliwiła jednoczesne badanie ekspresji do of valuable data. Microarray RNA expression on a genome-wide scale
kilkuset genów w ciągu kilkudziesięciu minut. Kolejnym etapem is now a proven technology, although the idea of analysis of expression
rozwoju biologii molekularnej stało się opracowanie systemu many genes in one sample is not new. The development of clone
jednoczesnej hybrydyzacji cRNA będącego produktem kilku tysięcy printing technology and oligonucleotide synthesis allowed to produce
genów, a zastosownie komputerowych technik odczytu i analizy high-density microarray. These systems together with more powerful
danych spowodowało, że systemy microarray stały się złotym and fast computer and software systems were applied not only in basic
standardem w badaniu ekspresji onkogenów, skutków działania science but also in clinical medicine and pharmaceutical industry. In this
czynników chemicznych i fizycznych na organizm żywy. Systemy publication the authors provide the information about the technology,
te pozwalają firmom farmaceutycznym na jednoczesne testowanie available detection systems and data analysis software. Comprehensive
wpływu wielu substancji chemicznych o potencjalnym działaniu review of current and fundamental papers using microarray technology
przeciwnowotworowym na ekspresję genów spełniających istotne application in rheumatoid arthritis, oncology, cystic fibrosis research,
funcje w rozmnażaniu się komórek nowotworowych. W artykule and allergic airways inflammation is also included.
autorzy omawiają szczegółowo techniczne aspekty technologii Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85
microarray, jej odmiany oraz przedstawiają wyniki dotychczasowego
zastosowania tych systemów w reumatologii, onkologii i chorobach Key words: RNA microarrays, gene expression, molecular methods
płuc. Autorzy przedstawiają również własne doSwiadczenia dotyczące in medicine
wykorzystania cDNA arrayu w badaniu zapalenia alergicznego
w komórkach nabłonka dróg oddechowych.
Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85
Słowa kluczowe: mikromacierze RNA, ekspresja genów, metody
molekularne w medycynie
Słownik skrótów i pojęć stosowanych w pracy:
cRNA komplementarne RNA, otrzymane w wyniku synte-
Ard-1 czynnik transkrypcyjny
zy RNA w oparciu o matrycę cDNA.
cDNA komplementarne DNA, otrzymane w wyniku synte-
DB1 (DNA binding protein 1) białko wiążące DNA,
zy w oparciu o matrycę mRNA
czynnik transkrypcyjny
CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Re-
EST (Expressed Sequence Taq) sekwencja kodująca
gulator) regulator przewodnictwa błonowego, od-
(mRNA)
powiada za istnienie zależnej od cAMP regulacji ka-
nału chlorkowego.
GelA żelatynaza A
c-jun czynnik transkrypcyjny wchodzący w skład kom-
GSCF czynnik stymujący wzrost kolonii granulocytów
pleksu AP-1
HME (human matrix metallo-elastase) ludzka elastaza
Col-1 kolagenaza 1
substancji miedzykomórkowej
CPX 8-cyklopentyl-1,3-dipropyl-ksantyna, anatagonista
IVT (in vitro transcription) synteza cRNA na matrycy
receptora adenozynowego A1
cDNA
Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85
78
Jednoczesne badanie ekspresji wielu genów nie jest badawczych i firm biotechnologicznych. Zastosowano przy
pomysłem nowym. Od kilkunastu lat próbowano zastoso- tym wiele systemów posługując się fragmentami genów
wać technikę RPA (RNAase Protection Assay) do jedno- uzyskanymi w technice PCR, plazmidami zwierającymi
czesnego iloSciowego i jakoSciowego badania kilku lub kil- sekwencje genów oraz syntetycznymi oligonukleotydami.
kunastu mRNA w jednej próbce. Wprowadzenie techniki Fragmenty cDNA lub oligonukleotydy były przy tym nano-
RT-PCR (odwrotna trankrypcja i łańcuchowa reakcja po- szone na szereg matryc, począwszy od membran nylono-
limerazy) umożliwiło badanie ekspresji kilku mRNA w jed- wych przez szklane szkiełka mikroskopowe, a skończyw-
nej próbce biologicznej wykorzystując tzw. multiplex PCR. szy na plastikowych płytkach [3]. Do nanoszenia oligonu-
kleotydów zastosowano również systemy druku przypomi-
Pomysł jednoczesnego badania ekspresji wielu genów
jące komputerowe drukarki atramentowe. [4].
nie pojawił się w ciągu ostatniej dekady kiedy to biolo-
gia molekularna rozwijała się szczególnie szybko. Zaled- W ciągu ostatniej dekady udoskonalono precyzję
wie w rok po wynalezieniu przez Karry Mullis a łańcu- i powtarzalnoSć wyników uzyskiwanych przy zastosowa-
chowej reakcji polimerazy, w 1987 roku L. Augenlicht niu microarray u, obniżono dramatycznie iloSć mRNA nie-
i wsp. zastosowali po raz pierwszy technologię cDNA mi- zbędnego do uzyskania nie budzących wątpliwoSci wyni-
croarray [1]. Naniesiono wówczas na paski nitrocelulozy ków, zwiększono również liczbę genów, których ekspre-
4000 sklonowanych sekwencji cDNA. Następnie wyko- sję można badać w jednym eksperymencie. Firmowy mi-
nano ich hybrydyzację ze znakowanymi radioaktywnie croarray jest w chwili obecnej w stanie mierzyć ekspre-
cDNA uzyskanymi z mRNA pochodzącymi z komórek sję ponad 10 000 genów w jednej próbce. Wydaje się, że
raka okrężnicy oraz prawidłowych komórek jelita. Techni- jedynym ograniczeniem dla zwiększenia liczby genów
ka ta w istocie była niczym innym jak odwróconą dot-blot w komercyjnie dostępnych microaaray ach jest stopień
hybrydyzacją i dostarczyła tysięcy radioaktywnych punk- z sekwencjonowania genomu człowieka (lub organizmu
tów, dla których liczba rozpadów na sekundę była wprost zwierzęcia doSwiadczalnego) oraz publiczna dostępoSć
proporcjonalna do bezwzględnej ekspresji danego genu w tych sekwencji.
badanych komórkach. Autorzy opracowali wówczas rów-
Ostatnie prace wykonane przy zastosowaniu techno-
nież system komputerowy pozwalający na odczyt, zapis,
logii microarray wskazują, że przy jej użyciu możliwe jest
analizę oraz graficzną prezentację uzyskanych danych.
wykrycie już dwukrotnego wzrostu ekspresji genu, dys-
System ten pozwolił na wykrycie różnic w ekspresji ponując zaledwie jedną kopią transkryptu na komórkę [5].
genów pomiędzy różnymi typami histologicznymi raka
Dalszy rozwój systemów mikrodrukowania, syntezy
okrężnicy, umożliwił wskazanie genów, których ekspresja
oligonukleotydów, a także gromadzenia i analizy danych
była inna w próbkach pobranych od pacjentów i w ho-
spowoduje prawdopodobnie dalszy postęp i zwiększenie
dowlach in vitro [2].
dostępnoSci microaarrayu, któremu będzie towarzyszył
W połowie lat 90. pomysł jednoczesnego badania eks- wzrost wymagań potencjalnych użytkowników.
presji wielu genów został przypomniany przez wiele grup
JAK grupa czynników transkrypcyjnych RAGE (Rapid Gene Expression) technologia RT-PCR
wykorzystująca uniwersalne startery, umożliwiają-
MIF (migration inhibitory factor) czynnik hamujący mi-
ce uzyskanie wstępnego produktu reakcji PCR jako
grację
wielu fragmentów kodujących geny; cięcie tak uzy-
MMP (matrix degrading metalloproteinase) metalo-
skanego produktu przy użyciu odpowiednich en-
proteinaza trawiąca substancję międzykomórkową
zymów restrykcyjnych pozwala na uzyskanie w wy-
MUC 18 mucyna 18 jedno z wielu białek wydzielanych przez
niku elektroforezy kilkudziesięciu fragmentów swo-
gruczoły Sluzowe oskrzeli
istych dla badanych genów
Multipleks PCR łańcuchowa reakcja polimerazy z wykorzy-
RPA (RNAase Protection Assay) technika iloSciowej
staniem wielu par starterów; umożliwia badanie eks-
oceny mRNA
presji wielu genów podczas jednej reakcji PCR
RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)
NF-E1 czynnik transkrypcyjny
reakcja odwrotnej transkrypcji i łańcuchowa reak-
ORF (Open Reading Frame) otwarta ramka odczytu,
cja polimerazy
sekwencja dojrzałego mRNA kodująca sekwencję
STAT grupa czynników traskrypcyjnych
aminokwasów
Strom-1 stromelizyna 1
PKA kinaza białkowa A
TIMPS (tissue inhibitor of metalloproteinase) tkanko-
PMA ester forbolu
wy inhibitor metaloproteinazy
Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metodą microarray . . .
79
Technologia Tabela I Porównanie dwóch systemów microarray ów
Technicznie wyrożnia sie dwa odrębne systemy:
cDNA microarray jest zwykle szkiełkiem podstawowym
cDNA microarray Microarray oligonukleotydowy
preparatu mikroskopowego, na którym mikrodrukarka dru-
(Gene ChipŁł)
kuje seryjnie cDNA o długoSci 0,5-2kb uzyskane w wy-
Zalety
niku klonowania produkty reakcji RT-PCR. Obecne moż-
" Duża elestycznoSć " Dowolne kształtowanie EST
liwoSci techniczne pozwalają potencjalnie na naniesienie
25 000 cDNA na powierzchni jednego szkiełka mikro- " Dowolne kształtowanie EST " Wysoka specyficznoSć
skopowego. Szklana płytka jest zwykle pokrywana poli- " NiezależnoSć od komercyj- " MożliwoSć detekcji olbrzy-
L-lizyną, do której cDNA zawieszone w 3xSSC wiąże
nych xródeł sekwencji miej iloSci genów w czasie
się spontanicznie. Inkubacja w temperaturze 100C po-
" MożliwoSć badania genów jednego array u
woduje denaturację cDNA i umożliwia usunięcie niezwią-
o nieznanej sekwencji
zanych cząsteczek. Alternatywną techniką jest niekowa-
Wady
lencyjne wiązanie cDNA do powierzchni szkła przygoto-
" PracochłonnoSć (klonowanie, " MożliwoSć stosowania
wanej uprzednio aminopropyletoksylenem przy użyciu 6M
sekwencjonowanie) array u tylko do częSciowo
tiocyjanianu sodu. Produkt otrzymany w wyniku reakcji
" Kłopotliwe przechowywanie (lub całkowicie) zsekwen-
PCR może zostać również zmodyfikowany przy użyciu
cDNA cjonowanych genomów
amin i związany do szkła pokrytego warstwą silikonu.
" Stosunkowo niewielka liczba " Wysoki koszt
Z opisanych powyżej systemów nanoszenia cDNA
badanych jednoczeSnie genów " Ograniczona przez dostawcę
na powierzchnię szkiełka mikroskopowego najczęSciej
" Brak wpływu na sekwencje liczba EST
stosowany jest sposób pierwszy, zapewniający stosunko-
oligonukleotydów " Wątpliwe definicje funkcji
wo pewne wiązanie i równomierne rozproszenie cząste-
niektórych genów
czek kwasu nukleinowego.
Podstawową zaletą tej technologii jest możliwoSć za-
stosowania własnych sekwencji oligonukleotydów, które
Istnieją rownież alternatywne technologie syntezy lub
nie zostały jeszcze opublikowane lub zgłoszone do Gene
(i) deprotekcji oligonukleotydów deprotekcja elektrycz-
Bank u. Technika ta pozwala również na zwiększenie
na opisana przez Southerna (US Patent 5667667, 1997),
czułoSci metody w stosunku do systemu Gene ChipŁł,
drukowanie oligonukleotydów na żelach o gruboSci 20m
przez wyeliminowanie wplywu polimorfizmu genów na
i inne.
stopień ekspresji. Umożliwia poza tym pełną kontrolę nad
liczbą i sekwencją badanych genów.
Oprócz dwóch najszerzej stosowanych technik opra-
GeneChipŁł (lub inaczej microarray oligonukleotydo- cowano również mniej popularne systemy wytwarzania
wy) natomiast jest plastykową płytką, na której bezpo- microarray ów, jak np. technologia mikrokuleczek, na po-
Srednio (in situ) wykonano syntezę oligonukleotydów tech- wierzchni których osadzono oligonukleotydy (Luminex),
niką fotolitograficzną. Po syntezie łańcucha oligonukle- które następnie hybrydyzuje się ze znakowanym fluore-
scencyjnie RNA i odczytuje w cytofluorymetrze przepły-
otydów lampa rtęciowa oSwietla powierzchnię płytki przez
wowym. Kanonen i wsp. [6] opracowali także system
odpowiednią przesłonę, powodując ich deprotekcję przez
hybryzyzacji in situ pozwalający na jednoczesny odczyt
usunięcie wrażliwych na Swiatło grup chemicznych. Jest
to typowy proces technologiczny, mający miejsce w każ- ekspresji do 1000 mRNA w próbce.
dej syntezie oligonukleotydów (np. starterów do reakcji
PCR). W technologii GeneChipŁł nie jest możliwe jednak
Uzyskiwanie cRNA i hybrydyzacja
oczyszczanie produktu (jak ma to miejsce podczas typo-
Materiałem wyjSciowym do microarray u są zwykle
wej syntezy oligonukleotydów). Stąd też wydajnoSć re-
komórki pobrane od pacjenta, tkanki lub komórki hodo-
akcji jest stosunkowo niska i wynosi ok. 90%. Syntetyzo-
wane in vitro, tkanki lub narządy zwierząt doSwiadczal-
wane oligonukleotydy zwykle mają długoSć mniejszą niż
nych. Czynione są również próby zastosowania materiału
30bp (zazwyczaj są to 25-mery). Fizycznie ich rozmiar
nie przekracza zazwyczaj 10m. Na powierzchni 2cm2 biopsyjnego z biopsji cienkoigłowej i wymazów z błon Slu-
zowych. Materiałem, który poddaje się procedurze hy-
może więc zmieScić się do 300 000 oligonukleotydów.
brydyzacji są fragmenty znakowanego fluorescencyjnie
Użytkownik ma możliwoSć wyboru między kilkunastoma
lub izotopowo cRNA. Aby z tkanki lub hodowli komórko-
dostępnymi zestawami genów pochodzących z genomu
wej otrzymać cRNA konieczne są następujące etapy
człowieka, szczura lub myszy.
(przedstawione na rycinie 1):
Porównanie zalet i wad obu systemów przedstawio-
no w tabeli I.
Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85
80
U C
Komórki lub tkanki pobrane od pacjenta
C C C U
G G
Komórki lub tkanki w hodowli in vitro
U G C G
A G
G G G C
C C
Izolacja całkowitego RNA
C G G G C U
C C C A
lub poli(A) RNA
G G
U U G C
A C
U U U G
A A
całkowite RNA lub poli(A) RNA A G U A
U A
C C G A
G C
G U G U
C C
Odwrotna transkrypcja A A A C
U U
U A A A U A
U U U G
A A
cDNA
C C C U
G G
C G U G
G A
A U G U
Transkrypcja in vitro (IVT) oraz
Plastikowa p
znakowanie fluorochromem
UGCUACGAA
fragment oligonukleotydu stanowi
antysensowne znakowane
UGACCGAAU fragment cRNA ulegaj
cRNA
znacznik fluorescencyjny
Hybrydyzacja
Ryc 2. Uproszczony schemat hybrydyzacji w microarray u oli-
gonukleotydowym
Kompleks cRNA-cDNA (lub
oligonukleotyd)
Szczegółowy opis metodyki jest dostępny w wielu
Barwienie i odczyt
podręcznikach microarray, nie mniej jednak nie sposób nie
100
poczynić kilku uwag dotyczących powyższych procedur.
Zwykle podkreSla się duże znaczenie wysokiej czy-
Analiza wyników
stoSci (małej zawartoSci białka) RNA. WiększoSć firm
0
produkujących microarray e nie poleca do uzyskiwania
0 2 3 24
RNA z tkanek i komórek klasycznej metody izolacji RNA
czas [h]
wg Chomczyńskiego (TriReagent, Trizol, a następnie wi-
Ryc. 1. Schemat analizy ekpresji genów przy użyciu microarray u
rowanie w gradiencie fenol: chloroform i precypitacja
RNA izopropanolem), ze względu na małą wydajnoSć tej
1. Izolacja RNA
techniki oraz duże zanieczyszczenie produktu białkami
Powszechnie stosuje sie izolację całkowitego RNA
i DNA. Standardem jest izolacja zestawem RNeasy (Qu-
lub też izolację poli(A) RNA, która zwykle umożli-
iagen). IloSć RNA niezbędna do dalszych etapów waha
wia otrzymanie wyników lepszej jakoSci.
się (w zależnoSci od wydajnoSci RT i IVT) od 30 do 50g.
2. Odwrotna transkrypcja (RT)
Liczba komórek niezbędna do uzyskania takiej iloSci RNA
W wyniku typowej reakcji RT otrzymuje się dwuni-
jest różna w zależnoSci od tkanki i wynosi od 0,5x107 do
ciowe cDNA. Reakcja ta składa się z dwóch eta-
5x107. Po uzyskaniu RNA konieczne jest okreSlenie jego
pów pierwotnie syntetyzowana jest pierwsza nić
stężenia oraz przeprowadzenie elektroforezy na żelu 1%
DNA na matrycy RNA, a następnie nić ta jest uży-
agaroza/MOPS celem upewnianie się, że uzyskane RNA
wana jako matryca do syntezy komplementarnego
nie jest zdegradowane i zawiera typowe prążki dla rybo-
DNA. W ten sposób powstaje dwuniciowy cDNA.
somalnego RNA.
3. Transkrypcja in vitro (IVT reaction in vitro trans-
cription) z towarzyszącym, wbudowaniem barwni-
Detekcja sygnału w microarray u
ka fluorescencyjnego
Powszechnie stosowanym systemem detekcji jest
W wyniku reakcji IVT powstaje antysensowna nić
cRNA, na którą składają się znakowane oligonukleo- odczyt fluorescencji wzbudzonej za pomocą lasera przy
zydy. Do znakowania można stosować zarówno izo- użyciu odpowiedniego systemu optycznego. Typowo kom-
topy promieniontwórcze, jak i biotynę. pleks cRNA-matryca oligonukleotydowa jest oSwietlany
4. Fragmentacja cRNA swiatłem o długoSci fali 488nm (dla biotyny i barwienia
streptawidyna-fikoerytryna). Powoduje to wzbudzenie flu-
Proces ten pozwala na uzyskanie fragmentów cRNA
o długoSci 35-200 par zasad, które mogą łączyć się orescencji o długoSci fali 570nm. Natężenie fluorescencji
z cDNA lub oligonukleotydami. jest proporcjonalne do liczby cząsteczek cRNA ulegają-
5. Hybrydyzacja do wybranego zestawu cDNA lub oli- cych hybrydyzacji do matrycy. System komputerowy prze-
gonukleotydów (ryc. 2.) twarza te dane na odpowiednią skalę kolorów. Zwykle
kolor czerwony oznacza geny, których ekspresja wzrosła
Temperatura i czas hybrydyzacji zależy od buforu,
w którym proces ten następuje. NajczęSciej stosuje przynajmniej pięciokrotnie w stosunku do dowolnie wy-
się zakres temperatur 45-65C przez około 16h. branych genów kontrolnych (ich liczba jest różna w za-
Ostatnim etapem jest barwienie kompleksu cRNA leżnoSci od eksperymentu; autorzy stosują zwykle od 4
oligonukleotydy streptawidyną i fikoerytryną. do 80 houskeeping genes jako kontrolę ekspresji),
ekspresji
Względny poziom
Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metodą microarray . . .
81
kolorem niebieskim oznacza się zazwyczaj geny, których Zastosowanie technologii microarray
ekspresja jest na poziomie kontroli.
Z chwilą opracowania technologii RT-PCR badacze
zaczęli odpowiadać na coraz bardziej złożone pytania doty-
czące ekspresji genów pod wpływem różnorodnych czyn-
Systemy analizy i obróbki danych otrzymywanych
ników, zarówno endogennych (cytokin, hormonów, pozio-
przy użyciu microarray u
mu jonów, cząsteczek adhezyjnych, niedokrwienia, niedo-
Typowy, pojedynczy eksperyment, składający się na-
tlenienia), jak i egzogennych (stres, promieniowanie). Wspó-
wet z jednego punktu czasowego tworzy zbiór danych
łczesna technologia umożliwiała jednak jednoczesne bada-
zawierający co najmniej kilka tysięcy punktów. Stwarza
nie ekspresji nie więcej niż 8-10 genów w jednym mRNA.
to poważny problem techniczny zarówno dla gromadze-
Differential display miał umożliwić badanie ekspresji kil-
nia danych, jak i dla ich analizy. Dane z odczytu groma-
kunastu - kilkudziesięciu genów w jednej próbce. Okazał
dzone są zwykle na dyskach CD-RW.
się jednak techniką niezwykle pracochłonną, a przy tym
Istnieje kilka programów komputerowych, służących
obarczoną stosunkowo dużą zmiennoScią, niejednokrotnie
do analizowania danych uzyskanych z microarray u. Jed-
uniemożliwiającą prawidłową interpretację wyników eks-
nym z najpopularniejszych jest GeneSpring firmy Silicon
perymentu. Dopiero jednoczesny postęp techniki syntezy
Genetics.
oligonukleotydów (a właSciwie jej miniaturyzacja) oraz po-
Analiza typowego eksperymentu składa sie z kilku etapów:
prawienie wydajnoSci klonowania genów, wraz z powszech-
1. instalacji nowego genomu (czyli zestawu informacji
ną dostępnoScią stosunkowo wydajnych systemów kom-
pozwalających na identyfikację poszczególnych ge-
puterowych, umożliwiły opracowanie i częSciowe wdroże-
nów i EST). Zwykle genom dostarczany jest przez
nie technologii microarray. Należy podkreslić, że jednocze-
producenta oprogramowania i na bieżąco aktualizo-
sna analiza wielu genów jest możliwa nie tylko przy użyciu
wany przez internet z taką samą czestotliwoScią jak
tego systemu. DoSć powszechnie w dalszym ciagu stosuje
modyfikacji ulegają array e.
się Northern-Blotting (który pozostaje złotym standardem
2. budowy nowego eksperymentu czyli pobrania przez
w naukach podstawowych), wielogenowy RT-PCR (mul-
program grupy plików uzykanych ze skanera,
tiplex RT-PCR), czy jego zmodyfikowaną wersję znaną jako
uwzględnienia punktów czasowych lub nazw stymu-
RAGE (Rapid Gene Expression) [7]. WspółczeSnie sto-
latorów, wybrania zakresu względnej i bezwględnej
suje się również wielogenowy RT-PCR w technologii Ta-
ekspresji sygnału. Zwykle istnieje również możliwoSć
qMan opracowny przez firmę Perkin Elmer. Wydaje się
przygotowania nowego eksperymentu korzystając
jednak, że mimo stosunkowo wysokich kosztów oraz skom-
z nowych danych, lecz posługując się poprzednio uży- plikowanej i długotrwałej obróbki danych uzyskanych w tej
wanym algorytmem, wprowadzając (lub nie) koniecz-
technologii, microarray zrewolucjonizuje zarówno techno-
ne modyfikacje.
logię badania ekspresji genów, jak i sposób analizy wyni-
3. standaryzacji ekspresji genów (zwykle program anali- ków i zapewne umożliwi lepsze poznanie szlaków metabo-
zy danych pozwala na standaryzację wyników w sto-
licznych, powiązań między genami oraz czynników wpły-
sunku do ekperymentu kontrolnego (np. RNA uzyka- wających na ich ekspresję. Wybrane zastosowania micro-
nego z niestymulowanych komórek) lub do ekspresji
array u przedstawiono w tabeli II.
okreSlonego (dowolnie wybranego przez użytkownika
Dotychczas opublikowane prace, wykorzystujące
genu lub nawet kilkudziesięciu genów). Standaryzacja
technikę jednoczesnego badania ekspresji wielu genów,
umożliwia przypisanie genowi lub genom ekspresji rów-
można podzielić na kilka grup:
nej dowolnej liczbie, zwykle jest to zero lub 9,95.
- badanie wpływu egzogennych lub endogennych czyn-
4. analizy eksperymentu, na którą składa się zwykle:
ników na ekspresję genów u pacjentów, w liniach ko-
wybranie listy interesujących badacza genów po-
mórkowych lub całych organizmach (Saccharomyces
sługując się odpowiednimi kryteriami np. pięcio-
cerevisiae) [8,9,10];
krotną zmianą ekspresji w stosunku do kontroli,
- poszukiwanie powiązań pomiędzy genami ulegający-
przygotowanie graficznej ekspresji pseudogenu,
mi ekspresji w okreSlonych warunkach (struktura pro-
a następnie znalezieniem wszystkich genów o po-
motorów, rozmieszczenie sekwencji wiążących czyn-
dobnym wzorze ekspresji,
niki transkrypcyjne, dystans pomiędzy nimi, odległoSć
przeszukanie bazy danych posługując się nazwą
od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, badanie alterna-
genu, skrótem lub numerem dostępu do GeneBan-
tywnych promotorów i dodatkowych ORF) [11];
ku, a następnie wyszukanie genu lub genów cha-
- identyfikacja genów kodujących ekspresję białek cy-
rakteryzująch się podobną ekspresją.
toplazmatycznych, błonowych i jądrowych [12];
5. analiza statystyczna. Zwykle stosowany jest test
- badanie ekspresji genów w nowotworach (różnice
t-Studenta lub jego modyfikacje.
w ekspresji pomiędzy tkanką zdrową, stanem przed-
Końcowe wyniki eksperymentu są zwykle przedsta-
rakowym oraz zmianą nowotworową). Badanie różnic
wiane za pomocą szeregu wykresów i diagramów oraz den-
w ekspresji genów w zależnoSci od typu histologicz-
drogramów popartych wynikami analizy statystycznej.
nego nowotworu [13,14,15].
Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85
82
Tabela II. Obecne i potencjalne zastosowania microarray u tomiast opisano wzrost ekspresji IL-3, HME, enzymu kon-
wertującego IL-1, oraz GRO-ą w reumatoidalnym zapa-
leniu stawów. Interleukina 3 zwykle jest wytwarzana przez
Zastosowanie microarray u Przykład praktycznego
aktywowane limfocyty T i fakt jej produkcji przez syno-
do badania ekspresji genów zastosowania
wiocyty i chondrocyty jest całkowicie nową obserwacją.
Badanie ekspresji genów Poszukiwanie skutecznych
Szczególnie interesujący wydaje się fakt, że HME jest
na poszczególnych etapach leków przeciwmalarycznych
jednym z białek będących celem terapii w reumatoidal-
rozwojowych drobnoustrojów
nym zapaleniu stawów. Enzym konwertujący IL-1 jest pro-
Wpływ czynników fizycznych Rola białek naprawczych
teazą cysteinową, która spełnia istotną rolę w indukcji apop-
na ekspresję genów w odbudowie uszkodzeń
tozy. Autorzy przedstawili również analizę porównawczą
DNA wywołanych promie-
nowaniem jonizującym ekspresji genów w tkankach objętych procesem zapalnym
Różnicowanie ekspresji genów Analiza patogenezy nowo- w dwóch chorobach reumatoidalnym zapaleniu stawów
w tkankach zdrowych tworów. Nowe leki przeciw- oraz chorobie Crohna, wykazując zbliżony stopień ekspre-
i zmienionych nowotworowo nowotworowe
sji IL-3, chemokiny GRO-ą oraz metalo-elastaz.
Zapalenie alergiczne Rola glikokorykosteroidów
w modyfikowaniu ekspresji
Różnice ekspresji genów w tkance zdrowej i ulega-
genów w nabłonku oskrzeli
jącej transformacji nowotworowej
Mukowiscydoza Badanie potencjalnych
możliwoSci terapeutycznych
cDNA microarray umożliwia precyzyjne grupowanie
nowych leków i wpływu
genów według szeregu kryteriów tworzących patern eks-
terapii genowej
presji zwany klasterem [17]. Perou i wsp. [18] zastoso-
wali powyższą technikę analizy ekspresji genów do po-
równania profilu ekspresji genów w normalnym nabłonku
przewodowym sutka oraz w tkance pobranej od pacjen-
W dalszej częSci pracy zostanie omówionych kilka
tek z nowotworem tego gruczołu. Autorzy stwierdzili ist-
istotnych historycznie lub ważnych naukowo oryginalnych
nienie podobnych profilów ekspresji genów w liniach ko-
prac z tego zakresu.
mórkowych podczas zahamowania wzrostu pod wpływem
osiagnięcia zlewnoSci (zjawisko zahamowania kontakto-
Analiza ekspresji genów w reumatoidalym zapale-
wego), jak w tkance nowotworowej inkubowanej w obec-
niu stawów
noSci TGF-1, IFN-ł, ą oraz po inkubacji w medium po-
Jedną z najwczeSniejszych prac, wykorzystujących
zbawionym obecnoSci EGF (Epidermal Growth Factor).
microarray była publikacja Heller i wsp. [16] badająca
Szczególnie uderzający jest wzrost ekspresji zależnych od
ekspresję ponad 1000 genów w tkance maziówki pocho-
interferonów genów, takich jak: 2 -5 syntaza oligoadeny-
dzącej od pacjentów w póxnym stadium reumatoidalnego
lowa E, białko 17kD stymulowane IFN czy STAT1. Induk-
zapalenia stawów. Autorzy wykorzystali technologię
cja powyższych genów zachodzi w wyniku aktywacji scieżki
cDNA array u. Tkanka maziówki wykazywała w wa-
JAK/STAT. Praca ta potwierdza potencjalne możliwoSci
runkach spoczynkowych stosunkowo niską ekspresję
zastosowania TGF-1, IFN-ł oraz interferonów w terapii
c-jun, GCSF, IL-3, TNF-, MIF oraz RANTES. Podob-
raka sutka. Wydaje się również, że zastosowanie antago-
nie ekspresja MMPs, GelA, Strom-1, Col-1 oraz TIMPS
nistów EGF może przynieSć istotny postęp terapeutyczny
była niska. Następnie pobraną od pacjentów maziówkę
w leczeniu tego nowotworu.
hodowano in vitro poddając stymulacji PMA, IL-1, lub
Badaniem różnic w ekspresji genów pomiędzy tkan-
TNF-ą. Stymulacja ta powodowała dramatyczny wzrost
ką zdrową a komórkami nowotworu wywodzącego się
ekspresji IL-6, IL-8, GRO-1ą, VCAM-1 oraz Strom-1,
z tej tkanki zajmowała się również grupa Laeikauf a, któ-
Col-1, Col-3 i HME. Podobny profil ekspresji wykazywa-
ra opublikowała w tym roku pracę porównującą ekspre-
ły również chondrocyty pobrane od pacjentów z reuma-
sję genów w międzybłoniaku oraz zdrowych komórkach
toidalnym zapaleniem stawów. Praca ta potwierdza fun-
nabłonka opłucnej [19]. Autorzy wyróżnili prawie trzysta
damentalną rolę TNF-ą w rozwoju reumatoidalnego za-
genów (spoSród ponad 6500 badanych przy użyciu cDNA
palenia stawów. Wzrost ekspresji tego genu wyprzedzał
microarrayu), których ekspresja była różna w komórkach
znacząco ekspresję IL-1ą, IL-1 oraz IL-6 i GCSF, wska-
tkanki zdrowej i międzybłoniaku opłucnej. Wspomniane
zując na kolejnoSć aktywacji scieżki cytokinowej w tej
300 genów podzielono na cztery grupy w zależnoSci od
jednostce nozologicznej. JednoczeSnie autorzy wykazali
spełnianej funkcji. Pierwsza, wyróżniona przez autorów
znaczącą przydatnoSć microarrayu do analizy następstwa
grupa, to geny odpowiedzialne za metabolizm wewnątrz-
zdarzeń w przebiegu zapalenia. WiększoSć genów opisy-
komórkowy i stabilizację DNA i mRNA. Komórki mię-
wanych przez autorów jest powszechnie znana jako me-
dzybłoniaka wykazywały ponad dwukrotnie zwiększoną
diatory procesu zapalnego. Dotychczas jednak niejasna
ekspresję syntetaz aminoacylo-tRNA, oraz innych białek
była kolejnoSć wzrostu ich ekspresji. Po raz pierwszy na-
odpowiedzialnych zarówno za transport jądrowy, jak
Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metodą microarray . . .
83
i wewnątrz siateczki endoplazmatycznej (np. karioptery- które z nich są bezpoSrednio odpowiedzialne za trans-
na -1, translokaza preprotein). Natomiast geny kodują- formację nowotworą, wskazuje jednak na te z nich, które
ce białka odpowiedzialne za hydrolizę protein (proteaza umożliwiają ekspansję oraz zapobiegają niszczeniu komó-
serynowa 11, a także katepsyna H) wykazywały ponad rek nowotworu przez cytostatyki. Wykrycie grup genów
trzykrotnie zmniejszoną ekspresję. Komórki międzybło- odpowiedzialnych za opornoSć na chemioterapię umożli-
niaka wykazywały również zwiększoną ekspresję genów wia poszukiwanie i badanie skutecznoSci nowych leków
odpowiedzialnych za stabilizację mRNA (ponad cztero- przeciwnowotworowych. Jest to całkowicie nowe zasto-
krotnie zwiększona ekspresja inhibitora rybonukleaz L) sowanie tej technologii [20,21].
oraz zmniejszoną ekspresję genów kodujących enzymy
Microarray został również zastosowany do analizy
odpowiedzialne za degradację kwasów nukleinowych (np.
wpływu cytostatyków na wzrost linii komórkowych wy-
rybonukleazy 4). Autorzy obserwowali również zwięk-
wodzących się z nowotworów. Scherf i wsp. [22] posłu-
szoną ekspresję genów kodujących enzymy metabolizu-
gując się grupą danych uzyskanych z 60 linii nowotworo-
jące lipidy oraz wpływające na różnicowanie się keraty-
wych, wykorzystywanych przez National Cancer Insti-
nocytów. Podobne wyniki otrzymali Khan i wsp. [13] ba-
tute przeanalizowali wpływ typowych leków przeciwno-
dając ekspresję genów odpowiadających za nowotworze-
wotworowych na ekspresję markerów wzrostu komórek
nie w mięsaku pęcherzykowym. Druga badana przez au-
na poziomie RNA. WSród 60 linii nowotworowych znala-
torów grupa genów odpowiada za procesy adhezji i ko-
zly się zarówno raki nerki, jajników, prostaty, płuc, jak i linie
munikacji wewnątrzkomórkowej. Komórki mesothelio-
białaczkowe, chłoniaki czy czerniak. Autorzy wykonali
ma wykazywały zwiększoną ekspresję integryn (ą3, ą4,
analizę ekspresji genów dla ponad 70 000 zwiąków che-
ą6, a także -1). Powyższe cząsteczki adhezyjne spe-
micznych o udowodnionym lub potencjalnym działaniu
łniają istotną rolę w rozwoju nowotworu zwiększając jego
przeciwnowotworowym. Praca ta umożliwiła pogrupowa-
zdolnoSć do nowotworzenia naczyń. Zwiększona ponad
nie nowotworów oraz leków (zarówno współczeSnie sto-
trzykrotnie ekspresja CD59 oraz zmniejszona (2,3 raza)
sowanych w terapii przeciwnowotworowej, jak i poten-
ekspresja MIF wskazuje, że białka te działają lokalnie prze-
cjalnie możliwych do zastosowania) w zależnoSci od sku-
ciwzapalnie umożliwiając ekspansję komórek nowotwo-
tecznoSci hamowania wzrostu linii nowotworowej oraz
rowych. Międzybłoniak, w przeciwieństwie do innych no-
wzajemnych interakcji lekowych. Autorzy przyznają, że
wotworów płuc, rzadko daje przerzuty. Przyczyną tego
nie są współczeSnie w stanie przeanalizować wszystkich
zjawiska jest ponad trzydziestokrotnie zwiększona ekspre-
uzyskanych danych koncentrując się zaledwie na kilku
sja PAI-2 genu, który również związany jest z niską in-
substancjach biologicznie czynnych. W ten sposób auto-
wazyjnoScią niedrobnokomórkowych nowotworów oskrzeli.
rzy stwierdzili istnienie ujemnej korelacji pomiędzy eks-
Innym genem, prawdopodobnie odpowiedzialnym za małą
presją DPYD (genu kodującego dehydrogenazę dyhydro-
inwazyjnoSć międzybłoniaka, jest trombospodyna 1. Oba
pirymidyny) a skutecznoScią 5-fluorouracylu (5-FU) w le-
geny zostały przez badaczy zaliczone do grupy genów od-
czeniu nowotworów, których komórki wykazują ekspre-
powiadających za inwazyjnoSć nowotworów. Kolejną
sję DPYD. 5-fluorouracyl okazał się lekiem skutecznym
wyróżnioną grupą genów są geny mające bezpoSredni
w terapii nowotworów, których komórki wykazywały ni-
wpływ na rozmnażanie się i wzrost komórek. Do grupy
ską lub nieobecną ekspresję DPYD. Wysoka ekspresja
tej należały głównie proto-onkogeny Ki-ras, c-myc, oraz
DPYD umożliwia komórkom nowotworu obniżenie eks-
białko wiążące c-myc. Podobnie ekspresja podstawowe-
pozycji na aktywną, ufosforylowaną formę 5-FU. Do-
go czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) oraz kinazy in-
Swiadczenie to wskazuje na nowe, choć ciągle potencjal-
dukowalnej surowicą były znacząco zwiększone w ko-
ne, zastowanie 5-FU w leczeniu nowotworów innych, niż
mórkach międzybłoniaka.
rak okrężnicy czy niektóre postacie raka sutka, w któ-
Międzybłoniak opłucnej jest nowotworem znanym z ol- rych to chorobach jest on stosowany współczeSnie. Au-
brzymiej opornoSci na chemioterapię, niemniej jednak torzy wykazali również bardzo wysoką skutecznoSć
molekularne mechanizmy tego zjawiska nie były dotych- L-asparaginazy w stosunku do linii nowotworowych po-
czas jasne. Rihn i wsp. wyróżnili wSród badanych genów chodzących z komórek ostrej białaczki limfatycznej. Cie-
grupę opornoSci na ksenobiotyki. Zaliczono do niej 4 geny kawe wydaje się również bardzo wysoka skutecznoSć tego
kodujące S-transferazę glutationu, 9 genów kodujących leku wobec linii komórkowej wywodzącej się z raka jajni-
grupę cytochromu P450 oraz geny o aktywnoSci detok- ka. Dwa opisane powyżej przykłady wskazują na szero-
sykacyjnej: hydrolazę epoksydową 2 i DPYD biorące kie możliwoSci zastosowania technologii microarray u
udział w detoksykacji 5-FU. Autorzy stwierdzili również w badaniu skutecznoSci leków przeciwnowotworowych
zwięszoną ekspresję genów istotnych w odpowiedzi na w zależnoSci od histologicznego typu nowotworu, a także
wolne rodniki (m.in. dysmutaza ponadtlenkowa Cu/Zn, an- umożliwiają potencjalny dobór leku w zależnoSci od spe-
neksyna I). Praca ta wskazuje na zasadnicze różnice po- cyficznych, indywidualnych dla pacjenta właSciwoSci ko-
między ekspresją genów w tkance nowotworowej i zdro- mórek nowotworowych. cDNA microarray umożliwia
wej. Nie odpowiada co prawda na podstawowe pytanie zarówno szybką jak i możliwie pełną analizę wpływu prak-
Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85
84
tycznie dowolnie szerokiego panelu substancji biologicz- woduje istotne zmiany ekspresji genów w nabłonku oskrzeli,
nie czynnych na ekpresję wielu tysięcy genów w komór- indukując wczesny i znaczący wzrost ekspresji receptora
kach nowotworowych. Systemy microarray u są aktual- beta2-adrenergicznego, IL-10 oraz podjednostki jej re-
nie szeroko wykorzystywane przez firmy farmaceutycz- ceptora, a także TGF-beta 2. Grupa genów charakteryzu-
ne w testowaniu zarchizowanych substancji o potencjal- jących się póxnym wzrostem ekspresji to anneksyna II i in-
nym działaniu przeciwnowotoworowym [23]. hibitor proteaz 1. Wyróżniono również grupę genów, któ-
rych ekspresja zmniejszała się dramatycznie już po dwóch
godzinach inkubacji z deksametazonem były to IL-12,
Zastosowanie microarray u w mukowiscydozie
IL-18, VCAM-1, TGF- 3 oraz CCR3. Dane te wskazu-
Współczesna genetyka molekularna specjalizuje się
ją, że już stosunkowo niskie stężenie glikokortykostero-
w poszukiwaniu związków pomiędzy fenotypem a okreS-
idów wykazuje silne miejscowe działanie przeciwzapalne
loną mutacja (lub polimorfizmem) [24]. Rzadko jednak
w komórkach nabłonka oskrzeli.
jesteSmy w stanie ustalić mikromolekularne konsekwen-
cje zmiany genotypu, wyrażające się zmianą ekspresji ge-
Podsumowanie
nów. Nie jesteSmy również w stanie przewidzieć skutków
terapii genowej na poziomie mRNA. Mukowiscydoza była Microarray stał się w ciągu ostatnich kilku lat techno-
jedną z pierwszych chorób, w których zastosowano tera- logią pozwalającą badać ekspresję nie tylko grup poje-
pię genową. Jest ona zwykle związana z obecnoScią mu- dynczych genów, ale wręcz całego genomu. Kolejne pra-
tacji "F508 genu CFTR. Powyższa mutacja zaburza trans- ce powstające w tej technologii przynoszą coraz lepsze
port białka CFTR z siateczki Sródplazmatycznej do błony i pełniejsze zrozumienie szlaków metabolicznych, procesów
komórkowej. Uniemożliwia to prawidłową regulację elek- nowotworzenia, odpowiedzi immunologicznej czy kontroli
trolitową zależną od cAMP przy użyciu kanału chlorko- procesu zapalnego. Co więcej, wraz z rozwojem badania
wego. Srivastava i wsp. [25] badali różnice w ekspresji ekspresji RNA pojawiają się DNA microarray e badające
genów w komórkach transfekowanych plazmidem zawie- strukturę genomu i jego polimorfizm oraz pierwsze
rającym gen CFTR lub jego mutację "F508. Mutacja microarray e badające ekspresję białka [27]. Coraz do-
"F508 powodowała istotną zmianę ekspresji 26 genów, skonalsze techniki ekperymentalne stanowią jednak nie-
co ciekawe były to głównie białka wiążące DNA (NF- spełnione wyzwanie dla systemów analizy danych. Uzy-
E1, DB1, ard-1). Następnie autorzy inkubowali obie linie skujemy z nich informacje, których, w chwili obecnej, nie
komórkowe w obecnoSci CPX (lek będący w tracie ba- jesteSmy w stanie w pełni wykorzystać. Pojawiają się także
dań klinicznych w mukowiscydozie). Lek ten należy do wtórne prace, wykorzystujące powszechnie dostępne, pu-
grupy ksantyn. Zmutowane białko CFTR charakteryzuje bliczne dane uzyskane z microarray u. W tabeli III przed-
się zaburzoną strukturę trzeciorzędową. CPX wiąże się stawiono krótką listę stron internetowych dotyczących mi-
ze zmutowanym białkiem "F508-CFTR, co powoduje croarray u. Lista ta zawiera adresy zarówno firm, labora-
zmianę jego struktury przestrzennej i umożliwia prawidło- toriów, a także naukowców zajmujących się tą tematyką.
wy transport z siateczki endoplazmatycznej do błony ko-
mórkowej [26]. CPX posiada również właSciwoSci akty-
Tabela III. Strony internetowe dotyczące microarray u
wujące "F508-CFTR. CPX jest również agonistą recep-
tora adenozynowego, co potencjalnie może wpływać na
www.affymetrix.com
ekspresję wielu genów. Inkubacja CPX z komórkami
cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html
transfekowanymi wariantami genu CFTR pozwoliła na
http://www.nhgri.nih.gov/DIR/LCG/15K/HTML/
wykrycie 69 genów, których ekspresja wzrastała znaczą-
Chroma.mbt.washington.edu/mod_www/
co w komórkach transfekowanych "F508-CFTR. Więk-
www.genomicsolutions.com
szoSć z nich nie była dotychczas kojarzona z mukowiscy-
http://www.genescan.com/
dozą. CzęSć z nich, jak MUC18, IL-10, PKA wydaje się
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/
spełniać istotną rolę w przebiegu choroby.
www.tigr.org
www.biorobotics.co.uk
Microarray a proces zapalny w komórkach nabłonka
cmgm.stanford.edu/~kimlab/wmdirectorybig.html
Glikokortykosteroidy są podstawowym lekiem prze-
ciwzapalnym stosowanym w chorobach alergicznych.
Najbliższe miesiące i lata powinny przynieSć zarówno
Dotychczas nie jest jasny profil ekspresji genów, na który
zwiększenie liczby genów dostępnych w microarray u, chi-
wpływają. Niepublikowane badania prowadzone w Cri-
py dla nowych mikroorganizmów oraz coraz doskonalsze
tical Care Medicine Department (National Institutes
systemy analizy danych.
of Health) (Pawliczak i wsp. [28]) wskazują, że stosunko-
wo niewielkie steżenie glikokorykosteroidów (10-9M) po-
Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metodą microarray . . .
85
PiSmiennictwo
1. Augenlicht LH, Wahrman MZ, Halsey H i wsp. Expression of 14. Howell SB. DNA Microarrays for Analysis of Gene Expression.
cloned sequences in biopsies of human colonic tissue and in Mol Urol 1999; 3: 295-300.
colonic carcinoma cells induced to differentiate in vitro. Cancer
15. Khan J, Saal LH, Bittner ML i wsp. Expression profiling in cancer
Res 1987; 47: 6017-6021.
using cDNA microarrays. Electrophoresis 1999; 20: 223-229.
2. Augenlicht LH, Taylor J, Anderson L i wsp. Patterns of gene
16. Heller RA, Schena M, Chai A i wsp. Discovery and analysis of
expression that characterize the colonic mucosa in patients at
inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays.
genetic risk for colonic cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:
Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 2150-2155.
3286-3289.
17. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO i wsp. Cluster analysis and
3. Schena M, Heller RA, Theriault TP i wsp. Microarrays:
display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci
biotechnology s discovery platform for functional genomics.
USA 1998; 95: 14863-14868.
Trends Biotechnol 1998; 16: 301-306.
18. Perou CM, Jeffrey SS, van de Rijn M i wsp. Distinctive gene
4. Bowtell DD. Options available from start to finish for obtaining
expression patterns in human mammary epithelial cells and breast
expression data by microarray. Nat Genet 1999; 21: 25-32.
cancers. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 9212-9217.
5. Iyer VR, Eisen MB, Ross DT i wsp. The transcriptional program
19. Rihn BH, Mohr S, McDowell SA i wsp. Differential gene
in the response of human fibroblasts to serum. Science 1999;
expression in mesothelioma. FEBS Lett 2000; 480: 95-100.
283: 83-87.
20. Cole KA, Krizman DB, Emmert-Buck MR. The genetics of
6. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A i wsp. Tissue
cancer a 3D model. Nat Genet 1999; 21: 38-41.
microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor
21. Kennedy GC. The impact of genomics on therapeutic drug
specimens. Nat Med 1998; 4: 844-847.
development [In Process Citation]. EXS 2000; 89: 1-10.
7. Wang A, Pierce A, Judson-Kremer K i wsp. Rapid analysis of
22. Scherf U, Ross DT, Waltham M i wsp. A gene expression
gene expression (RAGE) facilitates universal expression profiling.
database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet
Nucleic Acids Res 1999; 27: 4609-4618.
2000; 24: 236-244.
8. Amundson SA, Do KT, Shahab S i wsp. Identification of potential
23. Debouck C, Goodfellow PN. DNA microarrays in drug discovery
mRNA biomarkers in peripheral blood lymphocytes for human
and development. Nat Genet 1999; 21: 48-50.
exposure to ionizing radiation. Radiat Res 2000; 154: 342-346.
24. Califano A, Stolovitzky G, Tu Y. Analysis of gene expression
9. Holden PR, James NH, Brooks AN i wsp. Identification of a
microarrays for phenotype classification. ISMB 2000; 8 75-85.
possible association between carbon tetrachloride-induced
25. Srivastava M, Eidelman O, Pollard HB. Pharmacogenomics of
hepatotoxicity and interleukin-8 expression. J Biochem Mol
the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)
Toxicol 2000; 14: 283-290.
and the cystic fibrosis drug CPX using genome microarray
10. Koenen M, Scherf A, Mercereau O i wsp. Human antisera detect
analysis. Mol Med 1999; 5: 753-767.
a Plasmodium falciparum genomic clone encoding a nonapeptide
26. Pollard HB. Role of CPX in promoting trafficking and chloride
repeat. Nature 1984; 311: 382-385.
channel activity of wildtype and mutant CFTR. Pediatr Pulmonol
11. Heerdt BG, Che, Stewart LR i wsp. Polymorphisms, but lack of
1997; S14: 128-131.
mutations or instability, in the promotor region of the
27. Lueking A, Horn M, Eickhoff H i wsp. Protein microarrays for
mitochondrial genome in human colonic tumors. Cancer Res 1994;
gene expression and antibody screening. Anal Biochem 1999;
54: 3912-3915.
270: 103-111.
12. Diehn M, Eisen MB, Botstein D i wsp. Large-scale identification
28. Pawliczak R, Logun C, Danner R, Shelhamer J. Gene expression
of secreted and membrane associated gene products using DNA
in human airway cells after dexamethasone treatment. J Allergy
microarrays. Nat Genet 2000; 25: 58-62.
Clin Immunol 2001; 107(suppl.1): 108.
13. Khan J, Simon R, Bittner M i wsp. Gene expression profiling of
alveolar rhabdomyosarcoma with cDNA microarrays. Cancer
Res 1998; 58: 5009-5013.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Medytacja powoduje zmiany ekspresji genów4 Ekspresja genówMETODA ULTRADŹWIĘKOWA W BADANIU WYTRZYMAŁOŚCI BETONUW jaki sposob komórka reguluje ekspresję genów kodujacych receptory węchoweEKSPRESJA GENÓW KLONOWANYCH W WEKTORACH PLAZMIDOWYCH W ZREKOMBINOWANYCH SZCZEPACH E COLI(1)12 Regulacja ekspresji genowROLA REGULACJI EKSPRESJI GENÓW W STABILNOŚCI PLAZMIDÓWREGULACJA EKSPRESJI GENÓWREGULACJA EKSPRESJI GENOWTranskrypcja i jej rola w ekspresji genowBadanie czystości metodą klasycznąbadanie konsystensji zapraw budowlanych metodą stożka sprawozdaniezarzadzanie projektami badania operacyjne metoda cpmBadanie aktywności dehydrogenaz mikroorganizmów osadu czynnego metodą spektrofotometryczną z TTCwięcej podobnych podstron