Markery genetyczne
Markery DNA
" Marker genetyczny każda zmienność w DNA (polimorfizm) której obecność oraz
przekazywanie w następnych pokoleniach może być śledzona (niezależnie od metody detekcji)
o Markery morfologiczne (cechy zewnętrzne, będące wynikiem ekspresji genów)
Markery DNA
" Marker genetyczny każda zmienność w DNA (polimorfizm) której obecność oraz
przekazywanie w następnych pokoleniach może być śledzona
o Markery DNA bezpośrednio oparte na właściwościach kwasów nukleinowych (wykrywane
przez bezpośrednie analizy DNA)
o Allele, które można rozróżnić metodami molekularnymi jak reakcja łańcuchowa polimerazy
(PCR) czy metoda Southerna są także kodominujące.
Kodominacja Markery DNA
RFLP CAPS SSR
trawienie endonukleazą, PCR, trawienie PCR z użyciem
oznaczenie
Southern blotting endonukleazą produktu PCR odpowiednich starterów
typ mutacje punktowe, mutacje punktowe, zmiany długości sekwencji
polimorfizmu insercje, delecje insercje, delecje mikrosatelitarnych
typ
kodominacja kodominacja Kodominacja
dziedziczenia
wykrywanie
tak tak tak
alleli genu
gatunkowo specyficzny gatunkowo specyficzny oligonukleotydy komplementarne
genomowy DNA o małej genomowy DNA o małej do sekwencji flankujących
typ sondy
liczbie kopii liczbie kopii sekwencje powtórzone z 1-4
lub klony cDNA lub klony cDNA nukleotdami selekcyjnymi
na 3' lub 5'
DNA markers identify regions of DNA
Figure 2.1: DNA markers serve as landmarks that identify physical positions along a DNA molecule
Procedures for separation and
identification of DNA fragments
" Nucleic acid hybridization
To identify a specific DNA fragment in genomic DNA
" Polymerase chain reaction
To specifically and repeatedly replicate (amplify)
one fragment from genomic DNA
Enzymy restrykcyjne
" Enzymy bakteryjne zwane restrykcyjnymi endonukleazami.
" Przecinają cząsteczki DNA w obrębie specyficznych sekwencji, zwykle
4-8 zasad.
" Rozpoznawane przez nie sekwencje są palindromowe (symetryczne) =
identyczne na obu niciach czytanych w kierunku 5 do 3 .
" Każdy enzym rozpoznaje specyficzną sekwencję.
" Cięcie zwykle nie jest proste. Obie helisy są przecinane w miejscu
przesuniętym o kilka zasad.
" Wystające jednoniciowe końce tzw. lepkie.
Restriction enzymes cleave DNA at a specific sequence
Figure 2.9: Mechanism of DNA cleavage by BamHI
Restriction enzymes and their recognition sites
Haemophilus aegiptius GG/CC
Blunt cut
HaeIII
Staphylococcus aureus /GATC
5 -overhang
Sau3
A
Haemophilus GCG/C
3 -overhang
HhaI
haemolyticus
Serratia marcescens CCC / GGG
Blunt cut
SmaI
Escherichia coli RY13 G / AATTC
5 -overhang
EcoRI
Providencia Stuartii CTGCA / G
3 -overhang
PstI
Haemophilus aegiptius RGCGC / Y
Ambiguous
HaeII
sequence
Nocardia otitidis GC /
8 nt
NotI
GGCCGC
sequence
Poniższa liniowa cząsteczka DNA zawiera miejsca restrykcyjne rozpoznawane przez
enzymy AatII (A) i XhoI (X). Na załączonym diagramie z żelem proszę zaznaczyć
narysować prążki odpowiadające DNA po trawieniu:
a) AatII
b) XhoI
c) AatII i XhoI.
Size separation of DNA fragments
by electrophoresis in agarose gels
Negatively charged DNA moves toward the positive pole
Figure 2.10: Apparatus for gel electrophoresis
DNA migration
distance in a gel is
related to its size
Figure 2.11: Gel electrophoresis of DNA
DNA molecules must pass through pores in the gel -
smaller fragments migrate more rapidly
Nucleic acid hybridization
Figure 2.15: Nucleic acid hybridization
Southern blotting
" DNA fragments separated in a gel can be transferred to a
membrane for hybridization to a DNA probe
Figure 2.16: The Southern blot test
DNA polymerase adds nucleotides to the 3' end of a DNA chain
Figure 2.18: Addition of nucleotides to the 3'-OH terminus of a growing strand
PCR amplifies a specific DNA
fragment
" PCR requires two primers, one at
each end of the target DNA
" Each cycle doubles the amount of
target DNA
" Repeated cycles produce millions or
billions of copies
Figure 2.19: Role of primer sequences in PCR amplification
Steps of a PCR cycle
Each PCR cycle has 3 steps:
a. denaturation
b. annealing
c. DNA replication
Figure 2.20: PCR for amplification of particular DNA sequences
Rodzaje markerów molekularnych
" Liczne systemy markerowe umożliwiające identyfikację alleli
" Podstawowe różnice wynikają z charakteru samego markera:
czy pozwala on wykryć markery dominujące czy nie
jaki typ i poziom polimorfizmu (zmienności) potrafi zidentyfikować
jaka ilość i czystość DNA jest wymagana do analiz
jaki typ sondy potrzebny jest do detekcji (wykrycia) sygnału
czy wymagana jest znajomość sekwencji
trudności technicznych
wiarygodności
powtarzalności
kosztu analiz
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
(RFLP - ang. Restriction Fragments Lenght Polymorphism)
" Technika opiera się na trawieniu izolowanego DNA jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi.
" Produkt trawienia może być rozdzielony na żelu agarozowym.
" Z żelu następuje transfer prążków na membranę, hybrydyzacja ze znakowana radioaktywnie sondą
i detekcja sygnału przez autoradiografię (fluorescencję).
" Obecność lub brak prążka o określonej wielkości świadczy o polimorfizmie.
" Polimorfizm może tutaj wynikać:
ze zmiany pojedynczego nukleotydu w obrębie miejsca restrykcyjnego lub bliskiej odległości
od niego
ze zmiany większych fragmentów DNA
z metylacji niektórych zasad azotowych w DNA.
RFLPs are due to SNPs in restriction sites
Figure 2.23: A difference in the DNA sequence of two molecules can be detected
if the difference eliminates a restriction site.
RFLPs are
codominant
" RFLPs create DNA fragments of
different sizes.
" The fragments are the same size
in a homozygote.
" The fragments are different sizes
in a heterozygote.
Figure 2.24: In an RFLP, alleles may differ in the presence or absence of a cleavage site in the DNA.
Na zamieszczonym poniżej diagramie są zaznaczone fenotypy rodziców (X i Y). X i Y są homozygotami dla dwóch
markerów molekularnych RFLP, które są dziedziczone niezależnie od siebie.
Rodzic X ma genotyp A1A1B1B1, na żelu:
allel A1 odpowiada prążkowi o długości 4 kb
allel B1 odpowiada prążkowi o długości 6 kb.
Rodzic Y ma genotyp A2A2B2B2, na żelu:
allel A2 odpowiada prążkowi o długości 8 kb
allel B2 odpowiada prążkowi o długości 2 kb.
Proszę zaznaczyć na diagramie oczekiwany fenotyp pokolenia F1, jak również wszystkie możliwe fenotypy w
pokoleniu F2 wraz z prawdopodobieństwem pojawienia się każdego z nich.
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
A1A1B1B1 A2A2B2B2
x
F1: A1A2B1B2
Gamety A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B1 A1B1 A1B1 A1B1
A1B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A1B2 A1B2 A1B2 A1B2
A2B1 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B1 A2B1 A2B1 A2B1
A2B2 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2
A2B2 A2B2 A2B2 A2B2
Polimorfizm pojedynczego nukleotydu
(SNP - ang. Single Nucleotide Polymorphism)
" Bardzo licznie występujące w genomie pojedyncze mutacje punktowe.
" SNP stanowią ok. 90% całej zmienności występującej w ludzkim genomie i występują
co 100-300 nukleotydów na ogólną ich liczbę 3 mld (w Arabidopsis thaliana co około
300 pz).
" Technika polega na amplifikacji fragmentu genomu za pomocą reakcji PCR a następnie
sekwencjonowaniu powstałego produktu.
" Po sekwencjonowaniu fragmentów
należących do różnych osobników
porównuje się ich sekwencję
nukleotydową w celu identyfikacji SNP.
SNP chips are used to identify SNPs
Figure 2.22a: Oligonucleotides attached to a glass slide in a SNP chip can be used
to identify duplex DNA molecules containing alternative base pairs for a SNP.
SNP chips are used to identify SNPs
Figure 2.22b: DNA from genotypes that are homozygous TA/TA, homozygous
CG/CG, or heterozygous TA/CG each gives a different pattern of fluorescence,
revealing the SNP genotype of an individual
Polimorfizm sekwencji powielonej i pociętej
(CAPS - ang. Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)
" Technika oparta na połączeniu dwóch reakcji: reakcji PCR z trawieniem restrykcyjnym.
" Startery do reakcji konstruowane są na podstawie znanych sekwencji.
" Amplifikowany produkt jest następnie trawiony enzymem lub enzymami restrykcyjnymi i
rozdzielany na żelu agarozowym.
Conversion of the barley SNP marker GBS0734 into an EcoRV CAPS marker
Thiel i in. 2004
Polimorfizm długości prostych sekwencji
(SSLP ang. Simple Sequence Length Polymorphism)
" Szeregi powtórzeń sekwencji, przejawiające różnice długości
" Różne allele zawierają różną liczbę jednostek powtarzalnych
" Każdy SSLP może mieć wiele różnych wariantów długości
" SSLP może być wieloallelowe
" 2 typy SSLP:
Minisatelity zmienna liczba powtórzeń tandemowych (VNTR)
Mikrosatelity proste powtórzenia tandemowe (SSR)
Tandem repeat polymorphism
Figure 2.25: Different numbers of repeats can be distinguished by PCR using primers to the flanking DNA
Figure 3.6b Genomes 3 ( Garland Science 2007)
Tandem repeat polymorphisms
" SSR
~ 2-9 nt
abundant in the human genome
often highly polymorphic in human populations
" VNTR
~ 10-60 nt
useful in DNA typing (fingerprinting)
extra or missing copies of the genome of
greater than 1 kb
DNA fingerprinting
" Wykorzystuje się sekwencje DNA o dużej zmienności międzyosobniczej takie, w których występują
liczne polimorfizmy.
" W badaniach genetycznego odcisku palca bada się kilka-kilkanaście polimorfizmów, dzięki czemu
można uzyskać odpowiednio wysokie prawdopodobieństwo, że wskazuje on na określoną osobę.
Badania genetycznych odcisków palców stosuje się m. in. w kryminalistyce, czy do ustalania ojcostwa.
" Sekwencje repetytywne: sekwencje mini- i mikrosatelitarne (polimorfizmy VNTR, STR) oraz
polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP).
Genetic variation in a VNTR used in DNA typing
Figure 17.13
Courtesy of Robert W. Allen, Human Identity Testing Laboratory, Oklahoma
State University.
DNA profiling (also called DNA testing,
DNA typing, or genetic fingerprinting)
" It is a technique employed by forensic scientists to assist in the
identification of individuals by their respective DNA profiles.
" DNA profiling should not be confused with full genome sequencing.
" It is used in, for example, parental testing and criminal investigation.
Słowo Forensic (z ang.) oznacza identyfikowanie, zabezpieczanie, analizę i prezentację
dowodów (zarówno fizycznych, księgowych jak i elektronicznych) w sposób, który jest
prawnie akceptowany w sądzie.
Kobieta nie jest pewna, który z dwóch mężczyzn jest ojcem jej dziecka. Po pobraniu próbek krwi z
dziecka (D), matki (M) oraz obu mężczyzn (A i B), przeprowadzono badania genetyczne z użyciem
wysoce polimorficznych markerów DNA, znajdujących się na 2 różnych chromosomach (locus 1 i
locus 2). Wynik badań jest przedstawiony poniżej. Czy któreś z analizowanych loci pozwala na
wykluczenie lub potwierdzenie ojcostwa? Proszę krótko uzasadnić odpowiedz.
Wykorzystanie markerów DNA
" DNA fingerprinting
" Epidemiologia
" Antropologia
" Hodowla roślin i zwierząt (Marker assisted selection - MAS)
" Historia domestykacji
" Indykatory w ekologii
" Genetyka ewolucyjna
" Genetyka populacyjna
" Filogenetyka molekularna
" Markery genetyczne (Mapowanie genetyczne)
Molekularna hodowla roślin
(Marker assisted selection - MAS)
" MAS refers to the use of DNA markers that are tightly-linked to target loci as a substitute for or
to assist phenotypic screening.
" By determining the allele of a DNA marker, plants that possess particular may be identified
based on their genotype rather than their phenotype.
Simpler compared to phenotypic screening.
Selection may be carried out at seedling stage.
Single plants may be selected with high reliability.
Molekularna hodowla roślin
(Marker assisted selection - MAS)
International HapMap Project
" The International HapMap Project is a multi-country effort to identify and catalog genetic similarities and
differences in human beings.
" Using the information in the HapMap, researchers will be able to find genes that affect health, disease, and
individual responses to medications and environmental factors.
" The goal of the International HapMap Project is to compare the genetic sequences of different individuals to
identify chromosomal regions where genetic variants are shared.
" About 10 million SNPs exist in human populations.
" Alleles of SNPs that are close together tend to be inherited together. A set of associated SNP alleles in a region
of a chromosome is called a "haplotype".
" Most of the common haplotypes occur in all human populations; however, their frequencies differ among
populations. Therefore, data from several populations are needed to choose tag SNPs.
1000 (and 1) Genomes
" http://www.1000genomes.org/
" Recent improvements in sequencing technology ("next-gen" sequencing platforms) have sharply
reduced the cost of sequencing. The 1000 Genomes Project is the first project to sequence the
genomes of a large number of people, to provide a comprehensive resource on human genetic
variation.
" http://www.1001genomes.org/
" With the sequencing ofBy completing genome sequencing of 1001 genome saccessions, we will
not only fill in the gaps between the HapMap tag-SNPs, but also create a resource that is large
enough to be used directly for association mapping, and ideally reduce causal variants to
individual nucleotides. We will thus tremendously shorten the time required to link a specific
genotype to a particular phenotype.
Next-generation sequencing technologies
Nature Reviews | Genetics Vol. 11 | January 2010
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Wyklad 09 Podstawy Genetyki AIWyklad 13 Podstawy Genetyki AIWyklad 03 Podstawy Genetyki AIWyklad 10 Podstawy Genetyki AIWykład ekonomiczne podstawy07 Zastosowania genetycznych systemów uczących sięWyklad 07 (1)Wyklad 12 Podstawowe typy zwiazkow chemicznych blok s i p PCHN SKP studportWyklad 11 stacj Genetyka i biotechnologie lesneWyklad 07Rachunkowosc wyklad 9 leasing podstawyWYKŁAD 24 enzymopatie, genetyczne uwarunkowania chorób metabolicznych07 Podstawa opodatkowania VAT 2014 zajęciapsychiatria wyklady 07Wyklad 12 stacj Genetyka z biotechnwięcej podobnych podstron