kwasy nukleinowe

Przygotowanie: E. Jankowska, A. Szymańska, E. Wieczerzak, Katedra Chemii Medycznej, UG, 2012
KWASY NUKLEINOWE
WSZYSTKIE CZYNNOŚCI WYKONYWAĆ W RKAWICZKACH!!!
A. IZOLOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH Z DROśDśY
Zasada:
Izolowanie DNA wymaga rozdzielenia ró\nych frakcji komórkowych przez odwirowanie, a następnie oddzielenia DNA
od związanych z nim RNA i białek. Opisana poni\ej metoda izolowania dro\d\owego RNA polega na rozbiciu
komórek, usunięciu z roztworu białek i DNA za pomocą siarczanu dodecylu sodu (SDS), a następnie wytrącenie RNA
za pomocą etanolu.
Wykonanie
Metoda I:
W zlewce o pojemności 200 ml ogrzać do wrzenia stale mieszając 15 ml 5% roztworu SDS, a następnie do wrzącego
roztworu SDS dodać 5 g dokładnie rozdrobnionych świe\ych dro\d\y piekarskich i kontynuować ogrzewanie przez 1
min. Zlewkę umieścić we wrzącej łazni wodnej i ogrzewać, ciągle mieszając, przez 2 min. Zlewkę ochłodzić w lodzie
do temp. 4�C. Po schłodzeniu zawartość zlewki zwirować (5000 rpm, 10 min) w sterylnych naczyniach wirówkowych
(falconach). Nadsącz znad osadu zebrać, zmierzyć jego objętość w cylindrze miarowym i wlać do dwóch objętości
schłodzonego w lodzie 99% etanolu. Po 5 min odwirować (3000 rpm, 10 min) osad wytraconego kwasu nukleinowego.
Do osadu dodać 10 ml 70% EtOH, zworteksować i zwirować (5000 rpm, 10 min). Czynność powtórzyć dwukrotnie.
Krótko wysuszyć osad w odwróconej probówce (opartej na czystym kawałku bibuły) a następnie rozpuścić go w 10 ml
10 mM Tris, pH 8,0. Przechowywać na lodzie do dalszych analiz.
Metoda II:
W kolbie płaskodennej o objętości 250 ml doprowadzić do wrzenia 15 ml 5% roztworu SDS. Do wrzącego roztworu
dodać 5 g rozdrobnionych świe\ych dro\d\y piekarskich i całość ogrzewać przez 3 minuty, mieszając. Po ochłodzeniu
zawartość kolby wirować przez 10 min przy 5000 rpm. Supernatant przenieść do kolbki płaskodennej, dodać 2,5 ml
20% roztworu octanu potasu, a następnie 25 ml zimnego 98% etanolu. Mieszaninę pozostawić na łazni lodowej przez
1/2h, a następnie odwirować przez 10 min przy 5000 rpm. Roztwór znad osadu zdekantować, a otrzymany osad
kwasu nukleinowego przemyć 70% EtOH, jak w metodzie I. Po wysuszeniu rozpuścić w 10 ml 10 mM Tris, pH 8,0.
Przechowywać na lodzie do dalszych analiz.
B. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE
1. Hydroliza kwasowa RNA
Zasada
DNA i RNA ró\nią się podatnością na hydrolizę. W wyniku działania roztworów alkaliów na kwasy nukleinowe RNA
hydrolizuje z utworzeniem cyklicznych diestrów 2 - i 3 -mononukleotydów. DNA nie hydrolizuje pod wpływem zasad,
gdy\ nie posiada wiązań 2 -hydroksylowych. Oba kwasy nukleinowe hydrolizują w środowisku kwaśnym pod
działaniem mocnych kwasów (H2SO4, HCl, HCOOH) w podwy\szonej temperaturze, przy czym reakcja ta jest
wolniejsza dla DNA. RNA hydrolizuje ju\ pod wpływem 1 M kwasów w podwy\szonej temperaturze. Uwalniane są
wówczas zasady purynowe i nukleotydy pirymidynowe. Wiązania N-glikozydowe w nukleotydach pirymidynowych
(cytydyno-3 -P i urydyno-3 -P) są trwalsze i ulegają hydrolizie dopiero w stę\onych roztworach kwasów.
Wykonanie
Przygotować cztery długie probówki. Do pierwszej odmierzyć 5 ml roztworu wyizolowanego z dro\d\y kwasu
nukleinowego o stę\eniu 1 mg/ml (przygotowanego przez odpowiednie rozcieńczenie roztworu otrzymanego podczas
izolacji), do drugiej 5 ml standardowego roztworu DNA (stę\enie 1 mg/ml), do trzeciej 5 ml standardowego roztworu
RNA (stę\enie 1 mg/ml) a do czwartej 5 ml próbki nieznanej (otrzymanej od prowadzącego ćwiczenia). Do probówek
dodać po 5 ml 10% H2SO4 i ogrzewać we wrzącej łazni wodnej przez 45 minut. Otrzymany hydrolizat przechowywać
na lodzie.
1
Przygotowanie: E. Jankowska, A. Szymańska, E. Wieczerzak, Katedra Chemii Medycznej, UG, 2012
2. Wykrywanie cukrowców
Próba Molischa
Zasada
W wyniku działania stę\onego kwasu siarkowego na cukry powstaje furfural lub jego pochodne (w zale\ności od
rodzaju cukru). Reagując z ą-naftolem tworzą produkty o barwie czerwono-fioletowej.
Wykonanie
Do 4 probówek wprowadzić po 1 ml hydrolizatów kwasów nukleinowych, dodać 2-3 krople odczynnika Molischa, a
następnie ostro\nie podwarstwić ok. 0,2 ml stę\onego H2SO4 dodając go ze szklanej pipety Pasteura po ściance
probówki. Obserwować zmiany. Równolegle wykonać próbę kontrolną z wodą.
Wykrywanie pentozy próba Biala
Zasada
Wolne pentozy, fosfopentozy, jak te\ związane w nukleotydach purynowych w kwasach nukleinowych podczas
ogrzewania ze stę\onym HCl przechodzą w furfural, który w obecności orcyny (orcynolu) i katalitycznie działających
jonów Fe+3, tworzy kompleks o trwałej barwie zielonej, którego maksimum absorpcji przypada przy długości fali 610
nm. W tych warunkach deoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej od rybozy, dlatego odczyn ten dla DNA wypada du\o
słabiej (barwa jasnozielona) lub ujemnie. Reakcji tej nie daje ryboza związana z zasadami pirymidynowymi lub
amidem kwasu nikotynowego.
Wykonanie
Do 4 probówek wprowadzić po 1 ml hydrolizatów kwasów nukleinowych, dodać 1 ml 0,5% FeCl3 w 20% HCl a
następnie 1 ml 0,5% roztworu orcyny w 20% HCl. Zawartość probówek starannie wymieszać i ogrzewać w łazni
wodnej przez ok. 10 minut. Obserwować zmiany. Równolegle wykonać próbę kontrolną z wodą.
Wykrywanie pentozy próba Tollensa
Zasada
Pentozy ogrzewane ze stę\onym kwasem solnym przechodzą w furfural, który w środowisku kwaśnym reaguje z
floroglucyną tworząc barwny związek (czerwony).
Wykonanie
Do 4 probówek wprowadzić po 1 ml hydrolizatów kwasów nukleinowych, dodać 1 ml stę\onego HCl i 2 krople 5%
etanolowego roztworu floroglucyny. Roztwóry ogrzać do wrzenia w łazni wodnej. Obserwować zmiany. Równolegle
wykonać próbę kontrolną z wodą.
2. Wykrywanie zasad azotowych
Zasada
Zasady azotowe reagują z jonami Ag+ (lub Cu+), tworząc nierozpuszczalne sole kompleksowe.
Wykonanie
Do 4 probówek wprowadzić po 1 ml hydrolizatów kwasów nukleinowych, dodać 6-8 kropli stę\onego amoniaku (do
odczynu lekko alkalicznego, ocenionego papierkiem wskaznikowym). Roztwór przesączyć, jeśli nie jest klarowny. Do
klarownego przesączu dodać 0,3 ml 1% roztworu AgNO3. Obserwować zmiany. Równolegle wykonać próbę kontrolną
z wodą.
3. Wykrywanie obecności kwasu fosforowego
Zasada
Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO3, w wyniku czego powstaje nierozpuszczalny
fosfomolibdenian amonu, \ółto zabarwiony osad.
2
Przygotowanie: E. Jankowska, A. Szymańska, E. Wieczerzak, Katedra Chemii Medycznej, UG, 2012
Wykonanie
Do 4 probówek wprowadzić po 0.5 ml hydrolizatów kwasów nukleinowych, dodać stę\onego amoniaku do odczynu
obojętnego (ok. 3 kropli), ocenionego papierkiem wskaznikowym. Następnie dodać 0,5 ml stę\onego HNO3, po czym
2 ml 5% roztworu molibdenianu amonu. Probówkę z próbą wstawić do wrzącej łazni wodnej i ogrzać do wrzenia.
Obserwować zmiany. Równolegle wykonać próbę kontrolną z wodą.
C. ODRÓśNIANIE DNA OD RNA
Nukleotydy budujące DNA zawierają 2 -deoksy-D-rybozę, a RNA D-rybozę. Istnienie ró\nych pentoz jest podstawą
chemicznego odró\niania preparatu DNA od RNA.
Wykrywanie DNA metodą Dischego (reakcja z difenyloaminą)
Zasada
W środowisku kwaśnym (stę\onego H2SO4 i CH3COOH) deoksyryboza (wolna i związana w nukleotydach
purynowych) tworzy z difenyloaminą produkt kondensacji o barwie niebieskiej. Ta barwna reakcja jest konsekwencją
powstania aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem działania kwasu siarkowego i octowego.
Aldehyd ten kondensuje z difenyloaminą, tworząc produkt o barwie niebieskiej, którego maksimum absorpcji przypada
przy długości fali 600 nm. Oprócz deoksyrybozy reakcję tę daje tak\e kwas N-acetyloneuraminowy. Powstały produkt
w środowisku obojętnym lub zasadowym ma barwę \ółtą. Deoksyryboza związana z zasadami pirymidynowymi i
ryboza nie dają tego odczynu.
Wykonanie
Przygotować długie probówki. Do pierwszej dodać 1 ml roztworu RNA (c=1 mg/ml), do drugiej 1 ml roztworu DNA
(c=1 mg/ml), do trzeciej 1 ml roztworu kwasu nukleinowego wyizolowanego z dro\d\y (c=1 mg/ml), do czwartej 1 ml
roztworu kwasu nukleinowego otrzymanego do analizy, do piątej 1 ml wody (próba kontrolna). Następnie do ka\dej z
probówek dodać po 1 ml odczynnika difenyloaminowego i umieścić je we wrzącej łazni wodnej na 10 minut.
Obserwować zmiany. Zinterpretować uzyskane wyniki; wyjaśnić, która próba kwasu nukleinowego jest roztworem
DNA.
Wykrywanie RNA metodą orcynolową
Zasada
Jak przy wykrywaniu pentoz metodą Biala
Wykonanie:
Przygotować pięć długich szklanych probówek i umieścić w nich roztwory kwasów nukleinowych jak w ćwiczeniu
powy\ej. Do wszystkich probówek wprowadzić po 5 kropel 10% etanolowego roztworu orcyny, wymieszać i dodać 1
ml 0.1% FeCl3 w stę\onym HCl. Starannie wymieszać zawartość probówek, wstawić do wrzącej łazni wodnej i
ogrzewać do pojawienia się zmian. �Zinterpretować uzyskane wyniki. Wyjaśnić, która próba kwasu nukleinowego jest
roztworem RNA.
D. ILOŚCIOWE OZNACZANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH
1. Oznaczanie spektrofotometryczne
Zasada
Kwasy nukleinowe oraz nukleotydy, nukleozydy i zasady azotowe selektywnie pochłaniają światło w nadfiolecie (UV) z
maksimum przypadającym na 260 nm. Właściwość ta wynika głównie z obecności w kwasach nukleinowych zasad
purynowych lub pirymidynowych poniewa\ w badanym zakresie reszty cukrowe i grupy fosforanowe nie wykazują
absorpcji. Przeprowadzenie pomiaru absorbancji próbki kwasu nukleinowego dla dwóch długości fali (260 nm i 280
nm) mo\e być wykorzystane do oszacowania czystości badanego preparatu na podstawie wartości stosunku
absorbancji przy tych dwóch długościach (A260/A280). Dla wolnego od zanieczyszczeń dwuniciowego DNA wartość
współczynnika A260/A280 równa jest 1,8, dla czystego RNA - około 2, zaś dla czystego białka - poni\ej 1 (około 0,5).
Preparat DNA, którego wartość współczynnika A260/A280 jest większa od wartości 1,8, mo\e być zanieczyszczony
RNA, gdy współczynnik A260/A280 ma wartość poni\ej 1,8, to preparat zanieczyszczony mo\e być białkami.
3
Przygotowanie: E. Jankowska, A. Szymańska, E. Wieczerzak, Katedra Chemii Medycznej, UG, 2012
Wykonanie
Przygotować 15 probówek Eppendorfa. Do ka\dej dodać po 980 �l wody, a następnie do trzech po 20 �l roztworu
kwasu nukleinowego wyizolowanego z dro\d\y, do kolejnych trzech po 20 �l standardowego roztworu RNA, do
kolejnych 20 �l standardowego roztworu DNA i do ostatnich - po 20 �l 10 mM roztworu Tris (odnośnik).
W analogiczny sposób przygotować próbki o nieznanym stę\eniu: do 980 �l wody dodać
20 �l próbki otrzymanej do analizy. Wyzerować spektrofotometr UV-Vis na kuwety wypełnione roztworem Tris.
Zmierzyć wartość absorbancji dla długości fali 260 i 280 nm. Obliczyć wartość współczynnika A260/A280 i oszacować
czystość próbki. Obliczyć zawartość kwasu nukleinowego w próbce pomiarowej oraz jego stę\enie w próbce
otrzymanej do analizy, korzystając z następujących zale\ności:
dwuniciowy DNA: A=1 dla c=50 �g/ml
RNA A=1 dla c=40 �g/ml
KWASY NUKLEINOWE PLAN ĆWICZENIA
1. Izolacja kwasu nukleinowego metodą I lub metodą II.
2. Oznaczenie stę\enia otrzymanego preparatu (spektrofotometrycznie).
3. Otrzymanie roztworu 1% wyizolowanego kwasu nukleinowego.
4. Otrzymanie hydrolizatu wyizolowanego kwasu nukleinowego oraz hydrolizatów standardowych roztworów RNA i
DNA (dostępne u prowadzącego).
5. Wykonanie prób charakterystycznych dla DNA i RNA.
6. Badanie nieznanej próbki kwasu nukleinowego
a. wyznaczenie jej stę\enia (spektrofotometrycznie)
b. oznaczenie rodzaju kwasu nukleinowego.
ZAGADNIENIA NA KOLOKWIUM:
1. Jakie rodzaje kwasów nukleinowych wyró\niamy? Co je ró\nicuje?
2. Scharakteryzuj podatność RNA i DNA na hydrolizę kwaśną i zasadową. Z czego wynikają ewentualne ró\nice?
3. W jaki sposób mo\na odró\nić RNA od DNA?
4. Scharakteryzować rozpuszczalność kwasów nukleinowych w roztworach wodnych o odczynie kwaśnym,
zasadowym i obojętnym? Z czego ona wynika?
5. Jak zachowuje się wodny roztwór kwasu nukleinowego pod wpływem alkoholu? Jaka jest podstawa tego procesu?
6. W jaki sposób wydzielić kwas nukleinowy z roztworu?
7. W jaki sposób potwierdzić obecność składnika cukrowego kwasu nukleinowego?
8. Jak wykrywa się zasady azotowe w kwasach nukleinowych?
9. Jak wykryć obecność kwasu fosforowego w próbce kwasu nukleinowego?
10. Na czym polega próba Dischego?
11. Jak oznacza się stę\enie kwasów nukleinowych?
12. W jaki sposób określić mo\na czystość próbki kwasu nukleinowego?
LITERATURA:
1. I. śak (red) Chemia medyczna i Praktikum z chemii medycznej, Śląska Akademia Medyczna, Katowice 2001
2. Kołyszejko-Stefanowicz L. (red.): Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003
3. Hames B. D., Hooper N. M., Houghton J. D. Krótkie wykłady: Biochemia; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa
2002
4. Stryer L. Biochemia; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2000.
4

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Kwasy nukleinowe
Kwasy nukleinowe 2
Związki heterocykliczne i kwasy nukleinowe
cw 11 kwasy nukleinowe
BW13 KWASY NUKLEINOWE
kwasy nukleinowe 2
Kwasy nukleinowe
kwasy nukleinowe materialy
kwasy nukleinowe
kwasy nukleinowe wyklad inauguracyjny
kwasy nukleinowe i enzymy
nukleotydy i kwasy nukleinowe
Kwasy nukleinowe (2)
Kwasy nukleinowe wykład
KWASY NUKLEINOWE

więcej podobnych podstron