WIRUSOLOGIA I BAKTERIOLOGIA WYKAADY WYKAAD 1. PoczÄ…tki wirusologii. 29.09.2014 Wariolizacja-wdychanie wysuszonego materiaÅ‚u (strupy) /åRobert Koch i Ludwik Pasteur-intensywna praca nad wÅ›ciekliznÄ… (szczepienia); wprowadzenie nazwy wirus ; nie rozróżniali bakterii i wirusów jako odrÄ™bnych typów zarazków; PrzyczynÄ… chorób mogÄ… być różnego rodzaju zarazki /åDymitr Iwanowski- pierwsza obserwacja wskazujÄ…ca na istnienie odrÄ™bnej od bakterii grupy zarazków /åMartinus Willem Beijernick-dowiódÅ‚, że choroba mozaiki tytoniowej jest wywoÅ‚ywana przez coÅ› mniejszego od bakterii; jego badania doprowadziÅ‚y do powstania nowoczesnego pojÄ™cia wirusa; Wirus- rozpuszczalny, żywy zarazek /åFriedrich Lçffler i Paul Frosch-pryszczyca: przesÄ…czalne zarazki mogÄ… wywoÅ‚ywać choroby roÅ›linne i zwierzÄ™ce (przez lata poddawane w wÄ…tpliwoÅ›ci) /åKarl Landsteiner i Erwin Popper-1908: Poliomyelits wywoÅ‚ywane przez przesÄ…czalne zarazki /åFrederich William Twort-1915identyfikacja bakteriofagów /åFelix de2 H relle-1917: współodkrywca bakteriofagów; jako pierwszy wykorzystaÅ‚ terapiÄ™ fagami podczas I Wojny Åšwiatowej (dyzenteria); pierwsze bakteriofagi wyizolowaÅ‚ w poczÄ…tkach 1919r. z kurzych odchodów. Już w sierpniu tego samego roku zakoÅ„czyÅ‚o siÄ™ sukcesem leczenie bakteriofagami pierwszego pacjenta chorego na dyzenteriÄ™ /åFrancois Peyton Prous- badania nad kancerogennymi wirusami /åLudwik Gross-wykazaÅ‚ w sposób nie budzÄ…cy wÄ…tpliwoÅ›ci, że wirusy mogÄ… być przyczynÄ… chorób nowotworowych - Hodowla komórkowa (1925r.), lata 40-te i 50-te - Namnażanie wirusów w w/w hodowlach - Obecnie ponad 3200 linii komórkowych z ponad 75 gat. - 1939-skonstruowanie mikroskopu elektronowego (udoskonalonego w latach 40-tych) - Do 1939r.-pomiar wielkoÅ›ci czÄ…stek wirusowych przesÄ…cz przez filtry bakteryjne o znanej wielkoÅ›ci porów - Rozwój mikroskopii elektronowej-powiÄ™kszenie 100 000x Mikroskopy elektronowe dzielimy na: elektroniczny mikroskop transmisyjny (TEM) rejestruje elektrony przechodzÄ…ce przez próbkÄ™ elektroniczny mikroskop skaningowy (SEM) rejestruje elektrony rozproszone i wtórne TEM - wiÄ™ksze znaczenie do celów badawczych - uzyskiwane wiÄ™ksze powiÄ™kszenia wady: czasochÅ‚onna i pracochÅ‚onna preparatyka; uszkodzenie radiacyjnej próbki zalety: duża zdolność rozdzielcza; uzyskanie obrazu dyfrakcyjnego Mikroskop preparat (rozpÄ™dzona wiÄ…zka elektronów ) preparat szereg efektów: -część elektronów przechodzi przez preparat -elektrony mogÄ… być odbite od preparatu w zderzeniach sprężystych lub niesprężystych -elektrony mogÄ… wybijać z preparatu elektrony zwane wtórnymi SEM umożliwia uzyskanie trójwymiarowych obrazów czÄ…stek wirusów -elektrony wtórne powstajÄ… na skutek niesprężystych zderzeÅ„ elektronów bombardujÄ…cych próbkÄ™ z elektronami powÅ‚ok zewnÄ™trznych -elektrony wstecznie rozproszone -elektrony Augera -promieniowanie rentgenowskie-powstaje na skutek wybicia elektronu z wewnÄ™trznej powÅ‚oki MożliwoÅ›ci badawcze: duża zdolność rozdzielcza Mikroskopia krioelektronowa pozwala dojrzeć struktury wystÄ™pujÄ…ce na powierzchni wirusów. Wirus - bezwzglÄ™dne, wewnÄ…trzkomórkowe pasożyty - ich wymiary wynoszÄ… od 20-200 nm -aby utrzymać siÄ™ w Å›rodowisku, muszÄ… być zdolne do przenoszenia siÄ™ od gospodarza do gospodarza, zakażenia i namnażania we wrażliwych komórkach -patogeny te zawierajÄ… materiaÅ‚ genetyczny w postaci RNA lub DNA otoczony zewnÄ™trznym pÅ‚aszczem biaÅ‚kowym, nazywanym kapsydem. Dwie fazy istnienia wirusa: faza wirionowa wirus jako zÅ‚ożona inercyjna forma makroczÄ…steczkowa pozostaje poza organizmem żywej komórki faza replikacyjna wprowadzony do komórki wirusowy materiaÅ‚ genetyczny zmusza komórkÄ™ do wytworzenia wszystkich elementów skÅ‚adowych wirusa i powstania potomnych czÄ…stek -Wirusy infekujÄ… wszystkie żywe organizmy -Zjadamy i wdychamy ogromne iloÅ›ci wirusów -Nosimy w sobie genomy wirusów jako części wÅ‚asnego materiaÅ‚u genetycznego Dwa podstawowe typy czÄ…stek wirusów struktura helikalna- struktura ikosaedralna- paÅ‚eczkowaty ksztaÅ‚t: kulisty ksztaÅ‚t -paÅ‚eczkowaty -nitkowaty -baciloksztaÅ‚tny WYKAAD 2. 6.10.2014 Budowa czÄ…stek wirusowych i strukturze helikalnej. Najprostszy sposób wykorzystania wielu identycznych podjednostek do budowy bryÅ‚y geometrycznej o strukturze helikalnej polega na zastosowaniu zasad symetrii rotacyjnej Podjednostki biaÅ‚kowe o nieregularnych ksztaÅ‚tach powinny być uÅ‚ożone wokół obwodu koÅ‚a, tak aby podstawowÄ… formÄ… byÅ‚a struktura o charakterze dysku analiza czÄ…stek wirusów o strukturze helikalnej (dyfrakcja promieni X) wykazaÅ‚a, że kapsyd uÅ‚ożony jest z heliakalnie uÅ‚ożonych podjednostek, a nie struktur o charakterze dysku, uÅ‚ożonych jeden na drugim TMV Tobacco mosaic virus -NajwczeÅ›niej poznany wirus i budowie helikalnej -Lata 50-te XX w. - wykazano, że czysty kapsyd TMV w wyniku zmiany siÅ‚y jonowej i pH Å›rodowiska ulega rozpadowi (różnego typu struktury poÅ›rednie) -KAPSOMER- najprostsza bÄ™dÄ…ca wynikiem rozpadu (pojedyncza czÄ…steczka biaÅ‚kowa). Podstawowa struktura biaÅ‚kowa budujÄ…ca wirion TMV. -CzÄ…stka wirionu wirusa TMV zawiera 2130 kapsomerów -Kapsomer wirusa TMV zbudowany jest ze 158 aminokwasów tworzÄ…cych biaÅ‚ko -U wirusa TMV podstawowy element budowy kapsyd heliakalnego ( dysk ) utworzony jest z podwójnej warstwy kapsomerów, uÅ‚ożonych wzdÅ‚uż tej samej osi symetrii -Jeden peÅ‚en skrÄ™t helisy tworzy 16,3 podjednostek (przesuniÄ™cia wzglÄ™dem siebie) -Podjednostki w poszczególnych warstwach nie sÄ… uÅ‚ożone jedna na drugiej, lecz przesuniÄ™te wzglÄ™dem siebie o okreÅ›lony kÄ…t -Kolejno uÅ‚ożone na siebie dyski tworzÄ… nie stos dysków a strukturÄ™ podobnÄ… do krÄ™conych schodów, w Å›rodku której znajduje siÄ™ kwas nukleinowy -Podjednostki biaÅ‚kowe kapsydu , dziÄ™ki oddziaÅ‚ywaniom z RNA oraz pomiÄ™dzy sobÄ…, wymuszajÄ… na czÄ…steczce RNA genomu TMV helikalne zwiniÄ™cie -OddziaÅ‚ywania te sÄ… prawie jednakowe na caÅ‚ej dÅ‚ugoÅ›ci czÄ…stki wirusowej ( z wyjÄ…tkiem podjednostek znajdujÄ…cych siÄ™ na obu koÅ„cach czÄ…steczki RNA) Wszystkie wirusy o helikalnej strukturze wirionu można podzielić na dwie podstawowe grupy: wirusy posiadajÄ…ce sztywne tabularne czÄ…stki widocznym, centralnie poÅ‚ożonym kanaÅ‚em mieszczÄ…cym genomowy kwas nukleinowy (np. tobamowirusy TMV) wirusy posiadajÄ…ce stosunkowo dÅ‚ugie i giÄ™tkie czÄ…stki wirionowa ze sÅ‚abo widocznym kanaÅ‚em mieszczÄ…cym kwas nukleinowy (np. potywirusy, potekswirusy) Pomimo prostoty budowy kapsydów o strukturze helikalnej i ogromnej plastycznoÅ›ci w pakowaniu do nich czÄ…steczek genomowego kwasu nukleinowego, stosunkowo niewielki procent wirusów ma taki kapsyd. SpoÅ›ród wirusów roÅ›linnym 30 % wirusów wykazuje budowÄ™ helikalnÄ…. WÅ›ród wirusów zwierzÄ™cych nie opisano wirusa z nagim kapsydem helikalnym (jeÅ›li już jest kapsyd helikalny to zawsze osÅ‚oniÄ™ty osÅ‚onkÄ… wirusowÄ…). Budowa czÄ…steczek wirusowych o strukturze ikosaedralnej. UÅ‚ożenie kapsomerów (podjednostek biaÅ‚kowych) w formie pustej quasi-sferycznej struktury zamykajÄ…cej w Å›rodku kwas nukleinowy. -Struktura ta oparta jest na symetrii ikosaedralnej charakteryzujÄ…cej siÄ™ obecnoÅ›ciÄ… na jej 20 powierzchniach 60 identycznych elementów powiÄ…zanych ze sobÄ… podwójnÄ…, trójkÄ…tnÄ… i piÄ™ciokrotnÄ… osiÄ… symetrii -Podjednostki biaÅ‚kowe uÅ‚ożone zgodnie z takimi osiami symetrii tworzÄ… maksymalnie dużą bryÅ‚Ä™, w której wszystkie kopie podjednostek zajmujÄ… identyczne pozycje -Użycie podjednostek do konstrukcji ikosaedralnych bryÅ‚ gwarantuje Å›cisÅ‚Ä… kontrolÄ™ procesu ich skÅ‚adania i w sposób naturalny eliminuje czÄ…steczki defektywne Wirusy o zÅ‚ożonej strukturze wirionu. -Głównie wirusy bakteryjne -np. wirusy z rodziny Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae posiadajÄ… ornej (różnej dÅ‚ugoÅ›ci) -Najbardziej skomplikowanÄ… strukturÄ™ wykazujÄ… Coliphage T2, T4, T6, tzw. bakteriofagi T-parzyste Coliphage T4 -najlepiej poznany -ponad 40% informacji genetycznej dotyczy kopiowania biaÅ‚ek strukturalnych -skomplikowana droga skÅ‚adania czÄ…stek wirusowych zwiÄ…zana z pakowaniem DNA do struktur winionu -24 geny odpowiedzialne za formowanie główki -ponad 25 genów koduje biaÅ‚ka strukturalne ogonka i włókienek ogonka - 5 genów potrzebnych jest do kodowania biaÅ‚ek potrzebnych do skÅ‚adania czÄ…stek wirusa -główki, ogonki i włókienka ogonka sÄ… tworzone w oddzielnie przebiegajÄ…cych szlakach syntezy -po wbudowaniu DNA do główek fagowych nastÄ™puje poÅ‚Ä…czenie ze sobÄ… wyżej wymienionych elementów w caÅ‚ość -główka faga za pomocÄ… biaÅ‚ek tworzÄ…cych koÅ‚nierzyk, doÅ‚Ä…czony jest ogonek -ogonek zbudowany z wewnÄ™trznej tabularnej struktury rdzeniowej otoczonej kurczliwÄ…, heliakalnÄ… pochewkÄ… -wymiary ogonka sÄ… prawie identyczne we wszystkich czÄ…stkach wirusowych -ogonek zakoÅ„czony jest pÅ‚ytkÄ… podstawowÄ…, w którÄ… wbudowane sÄ… biaÅ‚ka enzymatyczne, odgrywajÄ…ce rolÄ™ przy wprowadzania kwasu nukleinowego faga do komórki -sześć wypustek odchodzÄ…cych od pÅ‚ytki podstawowej jest zbudowanych z dwóch części poÅ‚Ä…czonych ze sobÄ… pod okreÅ›lonym kÄ…tem, z których wewnÄ™trzna część przymocowana jest do pÅ‚ytki podstawowej -część zewnÄ™trzna odpowiedzialna jest za rozpoznanie odpowiednich receptorów komórkowych jest zupeÅ‚nie inna w różnych typach T-parzystych Geminivirusy -SkÅ‚adajÄ…ce siÄ™ z dwóch bryÅ‚ ikosaedralnych poÅ‚Ä…czonych ze sobÄ… -w każdej z bryÅ‚ w miejscu poÅ‚Ä…czenia czÄ…stka zawiera 110 monomerów biaÅ‚kowych zÅ‚ożonych w 22 morfologiczne podjednostki Wirusy z rodziny Retroviridae -nie posiadajÄ…ce osÅ‚onki -wiriony zbudowanie z dwóch warstw biaÅ‚kowych o odmiennym skÅ‚adzie, otaczajÄ…cych wiele segmentów genomowego dsRNA -zarówno zewnÄ™trzny kapsyd jak i wewnÄ™trzna część rdzeniowa zbudowane sÄ… zgodnie z zasadami klasyczne j symetrii ikosaedralnej -ich niezwykle skomplikowana budowa (nie do koÅ„ca poznana, spikes!) daje im ogromnÄ… odporność na czynniki zewnÄ™trzne (kilka miesiÄ™cy-kilka lat!) Kwas nukleinowy-jest genomem. Genom-genetyczny zapis cech wirusa. Decyduje i jego identycznoÅ›ci oraz podstawowych wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ciach. Stanowi od 0,1% masy czÄ…steczki wirusa do 42-46%. W każdej czÄ…stce wirusa wystÄ™puje albo RNA albo DNA, nigdy oba razem. U wiÄ™kszoÅ›ci wirusów roÅ›lin genom+kapsyd=wirion (kompletna czÄ…stka wirusa). BiaÅ‚ko peÅ‚ni głównie funkcjÄ™ ochronnÄ…. CzÄ™sto używa siÄ™ okreÅ›lenia okrywa biaÅ‚kowa lub pÅ‚aszcz biaÅ‚kowy (prawidÅ‚owa nazwa-kapsyd). U niektórych wirusów w skÅ‚ad wirionu wchodzÄ… jeszcze dodatkowa otoczka lipoproteinowa. Nukleokapsyd gdy biaÅ‚kowe struktury kapsydu zwiÄ…zane sÄ… bezpoÅ›rednio z kwasem nukleinowym. WYKAAD 3. 13.10.2014 Kwasy nukleinowe ·ð Najliczniej reprezentowane sÄ… wirusy roÅ›linne, których genomem jest pojedyncza, sensowna (plusowa) nić RNA [(+) ssRNA] single standard RNA ·ð PierwszÄ… trójkÄ… (triplet, kodon) nukleotydów jest kodon poczÄ…tkowy (startowy) AUG równoczeÅ›nie kodujÄ…cy metioninÄ™ jako aminokwas montowany w Å‚aÅ„cuchu polipeptydowym ·ð Jedna z trzech możliwych trójek nukleotydów UAG, UAA lub UGA stanowi kodon koÅ„czÄ…cy, czyli tzw. kodon stop. Kodony stop nie kodujÄ… żadnych aminokwasów, stanowiÄ… jedynie sygnaÅ‚ zakoÅ„czenia translacji otwartej ramki odczytu do okreÅ›lonego polipeptydu ·ð Nić sensowna nić mogÄ…ca być wykorzystana jako informacyjny RNA (mRNA) w procesie translacji. Może być tÅ‚umaczona bezpoÅ›rednio na odpowiednie biaÅ‚ko. Dwuniciowy RNA (dsRNA) ·ð Inna forma genomu wirusów roÅ›linnych ·ð Taka struktura zapewnia odporność na RNAzÄ™ (tybonukleazÄ™) Dwuniciowy DNA (dsDNA) ·ð taki genom majÄ… wszystkie wirusy z rodziny Caulimoviridae ·ð podwójna nić tworzy czÄ™sto kolistÄ…, otwartÄ… strukturÄ™ ·ð czÄ™ste dodatkowe skrÄ™canie siÄ™ i tworzenie wÄ™złów Jednoniciowy DNA (ssDNA) ·ð taki genom majÄ… wszystkie wirusy z rodziny Geminiviridae Wszystkie opisane do tej pory formy kwasów nukleinowych tworzacych genomy różnych wirusów sÄ… infekcyjne, podobnie jak peÅ‚ne wiriony. Tzn., że kwas nukleinowy wyizolowany z czÄ…stek wirusa po wprowadzeniu do komórki roÅ›linnej bÄ™dzie siÄ™ w niej namnażaÅ‚. Jednoniciowe RNA o antysensownej orientacji (-) ssRNA ·ð zachowuje siÄ™ odmiennie od uprzednio opisanych ·ð wolny, niepoÅ‚Ä…czony z resztÄ… kwasu ortofosforowego pozostaje wÄ™giel w postaci 3 ·ð ze wzglÄ™du na tÄ™ antysensownÄ… orientacjÄ™ te kwasy nie mogÄ… ulegać translacji w komórkach roÅ›lin i wobec tego nie namnażajÄ… siÄ™ po wyizolowaniu ich z czÄ…stek wirusa i wprowadzeniu do organizmu roÅ›linnego ·ð w peÅ‚nych czÄ…steczkach tych wirusów zawarta jest polimeraza RNA umożliwiajÄ…ca syntezÄ™ sensownej, zdolnej do translacji nici RNA (proces ten zapoczÄ…tkowuje namnażanie siÄ™ wirusa w roÅ›linie) BiaÅ‚ka wirusów roÅ›lin ·ð biaÅ‚ka wystÄ™pujÄ…ce w czÄ…stkach wirusów sÄ… pod wzglÄ™dem skÅ‚adu aminokwasowego identyczne z biaÅ‚kami wystÄ™pujÄ…cymi w organizmach żywych ·ð w skÅ‚ad biaÅ‚ek wchodzÄ… czÄ…steczki 20 pospolitych aminokwasów, ale rzadziej spotyka siÄ™ cysteinÄ™, histydynÄ™, metioninÄ™, tryptofan czy tyrozynÄ™ ·ð aminokwasy te tworzÄ… strukturalne podjednostki biaÅ‚kowe liczÄ…ce po parÄ™set czÄ…steczek aminokwasów poÅ‚Ä…czonych wiÄ…zaniami peptydowymi - CaÅ‚y kapsyd skÅ‚ada siÄ™ z kilkuset od kilku tysiÄ™cy podjednostek daje to możliwość upakowania caÅ‚ego genomu wirusa, którego stosunkowo niewielka pojemność informacyjna nie pozwala na kodowanie wiÄ™kszych biaÅ‚ek. - Kodowana jest tylko sekwencja aminokwasów w pojedynczej podjednostce. - U wszystkich wirusów roÅ›lin o genomie (+)ssRNA wystÄ™puje tylko jeden rodzaj takich podjednoste i wszystkie podjednostki biaÅ‚ka wirusa sÄ… identyczne. BiaÅ‚ka strukturalne stanowiÄ… skÅ‚adniki budulcowe czÄ…stek wirusów. Obecne w wirionach w stanie ich spoczynku. BiaÅ‚ka niestrukturalne peÅ‚niÄ… różne funkcje zwiÄ…zane z na przykÅ‚ad z rozmnażaniem lub transportem wirusów w roÅ›linach i pojawiajÄ… siÄ™ tylko w toku realizowania tych funkcji. PrzeciwciaÅ‚a rozpoznajÄ… antygen i starajÄ… siÄ™ go zneutralizować Antygen biaÅ‚ko podjednostek kapsydu wirusa Metody serologiczne metody badania wirusów Gammoglobuliny pojedyncza gammoglobulina przypomina literÄ™ Y. SkÅ‚adajÄ… siÄ™ na niÄ… dwa polipeptydy poÅ‚Ä…czone mostkami siarkowymi z grup tiolowych. Podstawa (trzonek) jest nazywana fragmentem Fc i nie jest istotna dla specyficznej reakcji przeciwciaÅ‚ z antygenem. Dwa jej ramiona, nazywane fragmentem Fab, odgrywajÄ… zasadniczÄ… rolÄ™, wiążąc siÄ™ specyficznie z antygenem, przeciwko któremu zostaÅ‚y wytworzone. Surowica czyste osocze z zawiesinÄ… przeciwciaÅ‚. PodstawowÄ… cechÄ… surowicy jest zawartość w niej specyficznych przeciwciaÅ‚. Miano surowicy okreÅ›lajÄ…c miano surowicy można wyrazić liczbÄ™ przeciwciaÅ‚. Jest to najwiÄ™ksze rozcieÅ„czenie w szeregu dwójkowym, które reaguje w widoczny sposób z wirusem. Krzyżowa reakcja serologiczna jest wtedy gdy np. surowica przygotowana przeciwko wirusowi M ziemniaka reaguje z wirusem S ziemniaka i na odwrót. Reakcja taka Å›wiadczy o pewnym stopniu pokrewieÅ„stwa serologicznego miÄ™dzy tymi wirusami. ELISA czyli test immunosorpcyjny ze zwiÄ…zanym enzymem. PodstawowÄ… zaletÄ… tego testu jest powlekanie pÅ‚ytek, w których przeprowadzono reakcjÄ™, przeciwciaÅ‚ami wypreparowanymi z surowicy uczulonej na wirus, który chcemy wykryć. (patrz książka, strony 163-166) Wirusy NIE rozmnażajÄ… siÄ™ pÅ‚ciowo. Wirusy nie ulegajÄ… podziaÅ‚om. Warunkiem rozpoczÄ™cia namnażania jest uwolnienie kwasu nukleinowego wirusa z otoczki biaÅ‚kowej. Dopiero w tej aktywnej formie kwas nukleinowy może siÄ™ replikować (przez odtworzenie nici komplementarnej na pierwotnej, wzorcowej nici kwasu nukleinowego i odÅ‚Ä…czanie powstajÄ…cego produktu od nici wzorcowej). Schemat rozmnażania wirusa o genomie ssRNA 1. Infekcja komórek roÅ›linnych przez czÄ…stki wirusa. Uwolnienie kwasu nukleinowego z otoczki biaÅ‚kowej. 2. ZwiÄ…zanie z rybosomami komórki roÅ›linnej, odpowiedni jego fragment ulega translacji do biaÅ‚ka enzym (polimerazy RNA, pierwszego produktu namnażania siÄ™ wirusa w komórce roÅ›linnej). RNA wirusa ze zwiÄ…zanymi z nim rybosomami (polirybosomy) mogÄ… nastÄ™pnie tworzyć inne biaÅ‚kowe produkty namnażania wirusa kodowane przez inne sekwencje wirusowego RNA. 3. Polimeraza RNA koduje komplementarne nici (-)ssRNA na rodzicielskich niciach (+)ssRNA wirusa w procesie ich transkrypcji. Liczba tych odwrotnych kopii genomu wirusa jest ograniczona, bo sÅ‚użą one tylko jako matryce do budowy komplementarnych, a wiÄ™c plusowych nici RNA i mogÄ… być wielokrotnie użyte do tego celu po odÅ‚Ä…czeniu produktu transkrypcji. 4. Matrycowe nici (-)ssRNA ulegajÄ… transkrypcji z udziaÅ‚em polimerazy RNA, do potomnych plusowych nici (+)ssRNA i w ten sposób zostaje odtworzony genom wirusa. Na tej samej matrycy (-)ssRNA powstaje kolejno wiele potomnych nici plusowych. Miejsca replikacji wirusowego RNA w komórce mogÄ… być różne i sÄ… z reguÅ‚y charakterystyczne dla rodzaju lub rodziny wirusów. Produktem transkrypcji matrycowej nici (-)ssRNA może być peÅ‚na kopia nici (+)ssRNA albo też jej odrÄ™bne fragmenty. 5. Potomne nici (+)ssRNA wirusowego oraz podjednostki biaÅ‚kowe sÄ… Å‚Ä…czone z udziaÅ‚em odpowiednich enzymów, w peÅ‚ni nowe wiriony gromadzone na terenie komórki roÅ›linnej, najczęściej w cytoplazmie. WYKAAD 4. 20.10.14r. MiÄ™dzynarodowy Komitet Taksonomii i Wirusów International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Nazewnictwo: -TMV Tobacco mosaic virus -ToMV Tomato mosaic virus PojÄ™cie gatunku wirusa: wirusy wykazujÄ… zjawisko zmiennoÅ›ci i specjalizacji, podobnie do organizmów żywych. Gatunek wirusa to politetyczny zbiór skÅ‚adajÄ…cy siÄ™ z wirusów reprezentujÄ…cych ciÄ…gÅ‚Ä… liniÄ™ replikacyjnÄ… i zajmujÄ…cych okreÅ›lonÄ… niszÄ™ ekologicznÄ… (Van Regenmortel, 2003) Cech okreÅ›lajÄ…cych zakres zbioru politetycznego jest wiele, wszystkie sÄ… równocenne a obiekty należące do zbioru niekoniecznie muszÄ… posiadać każdÄ… z tych cech. Wystarczy, że charakteryzuje je wiÄ™kszość z przyjÄ™tych cech. Ale / W praktyce najpierw brane sÄ… pod uwagÄ™ cechy ważniejsze: rodzaj genomu, morfologia czÄ…stek, potem mniej ważne: np. przenoszenie. Niektóre cechy sÄ… ogólnie pomijane. Cechy wirusów stosowane w taksonomii: Cechy wirionu -morfologia -ksztaÅ‚t wirionu -obecność lub brak osÅ‚onki -symetria i struktura kapsydu -wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci fizyczno-chemiczne i fizyczne -masa czÄ…steczkowa wirionu -wielkość pÅ‚awna wirionu -staÅ‚a sedymentacja wirionu -wrażliwość na pH -wrażliwość na jony (Mg, Mn) -stabilność termiczna -odporność na rozpuszczalniki -odporność na detergenty Genom -rodzaj kwasu nukleinowego (DNA, RNA) -wielkość genomu w pz/kpz -organizacja genomu -jedno- lub dwuniciowość -liniowość lub kolistość -polarność (dodatnia, ujemna, dwupolarność) -liczba i wielkość segmentów -sekwencje nukleotydów -obecność sekwencji powtórzeniowych -wystÄ…pienie izomeryzacji BiaÅ‚ka -liczba, wielkość i funkcjonalna aktywność biaÅ‚ek strukturalnych -liczba, wielkość i funkcjonalna aktywność biaÅ‚ek niestrukturalnych -dane dotyczÄ…ce specjalnej aktywnoÅ›ci biaÅ‚ek, szczególnie odwrotnej transkryptazy, transkryptazy, hemagintyniny, neuroaminidazy -peÅ‚na lub częściowa sekwencja aminokwasowa Replikacja -strategia replikacji -charakterystyka transkrypcji -charakterystyka translacji -miejsce nagromadzenia biaÅ‚ek wirionu -miejsce skÅ‚adowania wirionu -miejsce i charakter dojrzewania i uwalniania wirionu Lipidy -zawartość, rodzaj, itp. -obecność wÄ™glowodanów WÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci antygenowe -pokrewieÅ„stwo serologiczne WÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci biologiczne -zakres gospodarczy -sposób przenoszenia w Å›rodowisku naturalnym -zwiÄ…zek z przenosicielami Znaczenie struktury genomu wirusów w taksonomii. Sekwencja nukleotydów w kwasach nukleinowych homologiczna w: " 33-55% rodziny " 56-67% rodzaje " >68% gatunki, szczepy Wirusy roÅ›lin bez otoczki lipoproteinowej z otoczkÄ… lipoproteinowÄ… RNA DNA RNA SS DS SS DS SS Systematyka 2013 (2011) Taksony: - rzÄ™dy: 7 (6) - rodziny: 103 (97), w tym 77 nie zaliczono do rzÄ™dów - rodzaje: 407 (349) - gatunki: 2828 (2284) Order (rzÄ…d) koÅ„cówka virales Rodzina: Bromoviridae ª% sferyczne, trójczęściowy genom w oddzielnych czÄ…stkach zawierajÄ…cy (+) ssRNA ª% przenoszenie mechaniczne Rodzaj: Bromovirus (+mszyce na kÅ‚ujce) Gatunek: Bromemosaic virus BMV (wirus mozaiki stokÅ‚osy) Rodzaj: Cucumovirus (+mszyce na kÅ‚ujce) Gatunek: Cucumber mosaic virus CMV (wirus mozaiki ogórka) Rodzaj: Alfamovirus (+mszyce na kÅ‚ujce) Gatunek: Alfalfa mosaic virus AlMV (wirus mozaiki lucerny) Rodzaj: Ilarvirus (+pyÅ‚ek, nasiona) Gatunek: Apple mosaic virus ApMV (wirus mozaiki jabÅ‚oni) Rodzina: Bunyaviridae wirusy krÄ™gowców, owadów i roÅ›lin Rodzaj: Tospovirus ª% sferyczne, z otoczkÄ… lipoproteinowÄ…, 3 nici (-)ssRNA w jednej czÄ…stce ª% przenoszenie: wciornastki z rodzaju Thrips i Frankliniella, w sposób krążeniowy; mechanicznie Gatunek: Tomato spotted wilt virus TSMV (wirus brÄ…zowej plamistoÅ›ci pomidora) Rodzina: Caulimoviridae ª% sferyczne, dsDNA w jednej czÄ…stce Rodzaj: Caulimovirus ª% przenoszenie: mszyce w sposób półtrwaÅ‚y; mechanicznie Gatunek: Cauliflower mosaic virus CaMV (wirus mozaiki kalafiora) Rodzina: Closteroviridae ª% nitkowate (do 2000nm), (+)ssRNA w jednej czÄ…stce ª% przenoszenie: mszyce w sposób półtrwaÅ‚y; mechanicznie Rodzaj: Closterovirus Gatunek: Beet yellows virus BYV (wirus żółtaczki buraka) Rodzina: Luteoviridae ª% sferyczne, (+)ssRNA w jednej czÄ…stce ª% przenoszenie: mszyce w sposób krążeniowy Rodzaj: Luteovirus Gatunek: Barley yellow dwarf virus BYDV (wirus żółtej karÅ‚owatoÅ›ci jÄ™czmienia) Rodzaj: Polerovirus Gatunek: Potato leaf roll virus PEMV (wirus ostrej mozaiki grochu) (+mechanicznie) Rodzina: Potyviridae ª% nitkowate, (+)ssRNA w jednej czÄ…stce Rodzaj: Potyvirus (146 gat.) ª% przenoszenie: mszyce w sposób nietrwaÅ‚y na kÅ‚ujce; mechanicznie Gatunek: Potato virus Y PVY (wirus Y ziemniaka) Bean yellow mosaic virus BYMV (wirus żółtej mozaiki fasoli) Lettuce mosaic virus LMV (wirus mozaiki saÅ‚aty) Rodzina: Geminiviridae ª% sferyczne (blizniacze), ssDNA w jednej czÄ…stce Rodzaj: Begomovirus (288 gat.) ª% przenoszenie: mÄ…czliki (Bemsia sp.); mechanicznie Gatunek: Bean golden mosaic virus BGMV Cotton leaf curl Alabad virus CLCuAC Tomato golden mosaic virus ToGMV Rodzina: Reaviridae ª% sferyczne, dsRNA w jednej czÄ…stce Rodzaj: Fijivirus ª% przenoszenie: skoczki, piewiki (krążeniowo, namnażajÄ… siÄ™ w owadach) Gatunek: Fiji disease virus FDV Rodzina: Totiviridae ª% sferyczne, dsRNA w jednej czÄ…stce Rodzaj: Totivirus (wirusy grzybów) ª% przenoszenie: fragmentacja grzybów, zarodniki Gatunek: Saccharomyces cerevisiae virus L-A ScV-L-A Ustillago mayolis virus H1 UmV-H1 Aspergillus niger virus S AnV-S Gaecimannomyces graminis virus 87-1-H GgV-87-1-H Rodzina: Partitiviridae ª% kryptowirusy nie powodujÄ… u żywicieli zmian chorobowych ª% sferyczne, genom podzielony dsRNA w dwóch czÄ…stkach Rodzaj: Partitivirus (wirusy grzybów) ª% przenoszenie: fragmentacja grzybni, zarodników Gatunek: Fusarium solari virus 1 FsV-1 Agaricus bisporus virus 1 AbV-4 Heterobasidion annosum virus HaV Gaeumannomyces graminis virus 019/6-A GgV-019/6-A Diplocarpon rosae virus DrV Rodzina: Flexiviridae ª% czÄ…stki nitkowate, powyginane (470-1000nm) Rodzaj: Carlavirus ª% nitkowate, (+)ssRNA w jednej czÄ…stce ª% przenoszenie: mszyce w sposób nietrwaÅ‚y na kÅ‚ujce; mechanicznie Gatunek: Potato virus M PVM (wirus M ziemniaka) Potato virus S PVS (wirus S ziemniaka) Rodzaj: Potexvirus ª% nitkowate, (+)ssRNA w jednej czÄ…stce ª% przenoszenie: mechanicznie Gatunek: Potato virus X PVX (wirus X ziemniaka) Wirusy nie należące do żadnej z rodzin. Rodzaj: Tobamovirus ª% sztywne paÅ‚eczki, (+)ssRNA w jednej czÄ…stce ª% przenoszenie: mechanicznie, z nasionami (pomidora, papryki) Gatunek: Tobacco mosaic virus TMV (wirus mozaiki tytoniu) Tomato mosaic virus ToMV (wirus mozaiki pomidora) Rodzaj: Tobravirus ª% paÅ‚eczkowate, (+)ssRNA w dwóch czÄ…stkach ª% przenoszenie: mechanicznie, nicienie: Trichodorus i Paratrichodorus Gatunek: Pea early browning virus PEBV (wirus wczesnego brÄ…zowienia grochu) Tobacco rattle virus TRV (wirus nekrotycznej kÄ™dzierzawki tytoniu) WYKAAD 5. 27.10.2014 PRZENOSZENIE WIRUSÓW: 1) w roÅ›linie 2) z roÅ›liny na roÅ›linÄ™ 3) z roku na rok 1. W roÅ›linie Systemiczne opanowanie roÅ›lin przez wirusy. " etap I: z komórek epidermy do miÄ™kiszowych i dalej w stronÄ™ wiÄ…zek przewodzÄ…cych " etap II: dostanie siÄ™ do komórek wiÄ…zek przewodzÄ…cych " etap III: przemieszczanie siÄ™ w wiÄ…zkach przewodzÄ…cych " etap IV: przemieszczanie siÄ™ z wiÄ…zek przewodzÄ…cych do komórek miÄ™kiszowych i dalej do sÄ…siednich Transport wirusów w roÅ›linach ª% krótkodystansowy ( z komórki do komórki ) - powolny: przez plazmodesmy ( 5-15 µm/dobÄ™ ; opanowanie jednej komórki-5h) - w postaci wolnych kwasów nukleinowych, rzadziej caÅ‚ych wirionów - rola biaÅ‚ek transportowych kodowanych przez wirusa: * zwiÄ™kszanie przepustowoÅ›ci plazmodesm * wiÄ…zanie biaÅ‚ek z jednoniciowymi kwasami nukleinowymi * rozwijanie kwasów nukleinowych do form liniowych o prostej pierwszorzÄ™dowej strukturze Ø 2nm ª% dÅ‚ugodystansowy - szybki: głównie floemem (10cm/h), rzadko ksylemem (25cm/h) - w postaci wolnych kwasów nukleinowych, być może w formach dwuniciowych (doÅ›wiadczenie Selima) Rozmieszczanie wirusów w roÅ›linie zależy od gatunku wirusa i sposobu przemieszczania ( czÄ™sto nierównomierne zasiedlenie roÅ›liny ) - w komórkach miÄ™kiszu - we floemie, tylko w czasie przemieszczania ( rurki sitowe nie majÄ… jÄ…der ) - sporadycznie w ksylemie - tkanki merystematyczne, szczególnie stożki wzrostu wolne od wirusów - tylko ok. 15% dostaje siÄ™ do nasion 2. Z roÅ›liny na roÅ›linÄ™ " z sokiem chorej roÅ›liny ( mechanicznie ) - kontakt roÅ›liny chorej z zdrowej z Å›rodowiskiem ( mikrouszkodzenia, zabiegi uprawowe ) - mechaniczna inokulacja roÅ›lin wirusami w pracach badawczych " w wodzie i powietrzu niewielkie znaczenie cieki i zbiorniki wodne ( 38 gat. wirusów ) " w glebie np. przez nicienie, zarodniki pÅ‚ywkowe grzybów " wektory - pierwotniaki ( przenoszenie z zoosporami, obecność w zarodniach przetrwalnikowych ) * Polymyxa betae Beet borne mosaic virus * Polymyxa graminis Barley yellow mosaic virus - grzyby * Olpidium brassicae ( przenoszenie z zoosporami ) * przenoszenie Tobacco necrois virus na tulipany choroba Augusta - nicienie ( adsorpcja do kutykularnej wyÅ›ciółki przednich części przewodu pokarmowego ) * rodzaj Nepovirus ( Longidorus sp., Paralongidorus sp., Xiphinema sp. ) * rodzaj Tobravirus ( Trichodorus sp., Paratrichodorus sp. ) * Longidorus przenoszenie do 3 miesiÄ™cy * Xiphinema, Trichodorus do 7 miesiÄ™cy - owady * mszyce wirusy przenoszone na kÅ‚ujce (nietrwaÅ‚e) + krótki okres retencji ( do kilku minut ) + brak okresu latencji + wystÄ™pujÄ… w komórkach skórki i miÄ™kiszu roÅ›liny + mogÄ… być przenoszone mechanicznie wirusy przenoszone na kÅ‚ujce (półtrwaÅ‚e) + okres retencji do kilkunastu godzin wirusy krążeniowe (trwaÅ‚e) + dÅ‚ugi okres retencji + dÅ‚ugi okres latencji + wystÄ™pujÄ… w komórkach sitowych roÅ›liny + zwykle nie sÄ… przenoszone mechanicznie * wciornastki + TSMV wirus brÄ…zowej plamistoÅ›ci pomidora ( Tospovirus ) + r-j. Thrips przenoszenie krążeniowo-rozmnożeniowe ( nabywajÄ… larwy, przenoszÄ… owady uskrzydlone ) * chrzÄ…szcze ( stonkowate, biedronkowate, ryjkowcowate ) + przenoszenie zbliżone do krążeniowego ( Tymovirus, Comovirus ) * piewiki, skoczki + ( Fijivirus, Curtovirus, Oryzovirus ) + przenoszenie krążeniowo-rozmnożeniowe, krążeniowe * inne: mÄ…czliki, szpeciele, czerwce 3. Z roku na rok ( zimowanie ) - w materiale rozmnożeniowym (wegetatywnym) - zimowanie w wektorach (krążeniowe) - w roÅ›linach zimujÄ…cych - przez zrastanie siÄ™ korzeni roÅ›lin wieloletnich - sporadycznie wirusy mogÄ… przetrwać w podÅ‚ożu i resztkach roÅ›lin WYKAAD 6. 3.11.2014 1. Wirusologia roÅ›linna przenoszenie wirusów, wybrane choroby wirusowe i sposoby ich ograniczania. 2. Zmienność wirusów. Ad. 1 WIRUSY to czÄ…steczki organiczne nieposiadajÄ…ce struktury komórkowej, zbudowane z biaÅ‚ek i kwasów nukleinowych. ZawierajÄ… materiaÅ‚ genetyczny w postaci RNA lub DNA. NamnażajÄ… siÄ™ przez infekowanie żywych komórek. Do namnażania wykorzystujÄ… aparat kopiujÄ…cy zawarty w komórkach gospodarzy. Wirusy genetycznie i strukturalnie sÄ… najniższÄ… formÄ… życia. PojedynczÄ… czÄ…steczkÄ™ wirusa nazywamy wirionem. WIROIDY I. Wiroidy sÄ… to najmniejsze, autonomicznie replikujÄ…ce siÄ™ czynniki chorobotwórcze. Biochemicznie sÄ… to niskomolekularne, nagie, jednoniciowe, koliste lub liniowe RNA, skÅ‚adajÄ…ce siÄ™ z 240-350 nukleotydów. Ubogi genom nie koduje żadnego biaÅ‚ka specyficznego dla wiroida, przez co jeszcze bardziej niż wirus zależy od gospodarza. II. RoÅ›liny sÄ… zakażane przez zranienia wywoÅ‚ane mechanicznie. Sporadycznie mogÄ… być przenoszone przez mszyce, ale tylko wtedy, gdy bÄ™dÄ…c w kompleksie z wirusem, zostajÄ… opÅ‚aszczone wraz z RNA wirusowym. III. Aatwo sÄ… przenoszone z materiaÅ‚em roÅ›linnym rozmnażanym wegetatywnie. IV. MogÄ… być także przenoszone przez pyÅ‚ek i nasiona. V. Wykrywanie wiroidów opiera siÄ™ na technikach wykrywajÄ…cych RNA. PRZENOSZENIE WIRUSÓW WEKTORY S ISTOTNE W PRZEÅ»YCIU WIRUSÓW I W EPIDEMIOLOGII CHORÓB WIRUSOWYCH. SPOSOBY PRZENOSZENIA WIRUSÓW : 1. Mechanicznie przez zranienia (czÄ™sto przez czÅ‚owieka). 2. Przez owady (mszyce, skoczki, wciornastki, mÄ…czliki itp.) A) NietrwaÅ‚y: - krótki żer nabycia - natychmiastowe przenoszenie - szybka utrata zdolnoÅ›ci do przenoszenia B) TrwaÅ‚y : - dÅ‚ugi okres nabywania zdolnoÅ›ci do przenoszenia - dÅ‚ugi okres przenoszenia C) PółtrwaÅ‚y Mechanizmy przenoszenia sÄ… różne dla różnych wirusów: A) Dla kukumowirusów niezbÄ™dna jest tylko otoczka biaÅ‚kowa (wirion). B) Dla potywirusów musi być obecne biaÅ‚ko kodowane przez wirusa (czynnik pomocniczy = helper component) 3. Przenoszenie przez nasiona ok. 25% wirusów 4. Przez nicienie specyficznie 5. Przez grzyby i pierwotniaki (chorobotwórcze- Olpidium ssp., Polymyxa ssp.) ok. kilkanaÅ›cie wirusów. 6. Szczepienie, z sadzonkami, z pyÅ‚kiem, przez kaniankÄ™ Wirusy sÄ… przenoszone przez nasiona na dwa sposoby: 1. Na powierzchni nasion (kontaminacja): - wirusy trwaÅ‚e - koncentracja wirusa na nasionach przypadkowa, czÄ™sto wysoka - możliwość inaktywacji wirusa 2. W zarodku - przenoszenie warunkowane genetycznie - koncentracja wirusa w zarodku zależy od wirusa, szczepu, gatunku i odmiany roÅ›liny, czÄ™sto bardzo niska - inaktywacja wirusa utrudniona lub niemożliwa Ok. 30% wirusów jest przenoszonych przez nasiona. Nasiona skażone wirusami sÄ… najsÅ‚abszym ogniwem w kontroli rozprzestrzeniania siÄ™ wirusów. SPOSOBY OGRANICZANIA WYSTPOWANIA WIRUSÓW Praktycznie niemożliwe jest bezpoÅ›rednie zwalczanie wirusów, a jedynie ogranicza siÄ™ ich wystÄ™powanie poprzez: nie dopuszczanie ich na plantacje, zapobieganie rozprzestrzenianiu (usuwanie chorych roÅ›lin, eliminowanie wektorów, higienÄ™) oraz stosowanie różnych form odpornoÅ›ci. IstotnÄ… rolÄ™ w ograniczaniu wystÄ™powania wirusów odgrywa ich wykrywanie na różnych etapach uprawy roÅ›lin (nasiona, sadzonki roÅ›lin) celem eliminowania zródeÅ‚ wirusa. 1. Niedopuszczanie do wprowadzania wirusów na teren kraju. 2. Niedopuszczanie do rozprzestrzeniania wirusów na terenie kraju (materiaÅ‚ propagacyjny wolny od wirusów). 3. Eliminowanie lokalnych zródeÅ‚ wirusów : - usuwanie chorych roÅ›lin - eliminowanie alternatywnych gospodarzy - niszczenie skażonego materiaÅ‚u roÅ›linnego 4. Unikania wirusów : - odpowiedni termin siewu - izolacja przestrzenna 5. Odporność : - konstytucjonalna - krzyżowa (cross-protection) - systemiczna odporność nabyta (SAR) - systemiczna odporność indukowana (ISR) - potranslacyjne wyciszanie genów - na przenoszenie wirusów przez nasiona 6. Dezynfekcja 7. Ochrona roÅ›lin przed zakażeniem i rozprzestrzenieniem - zabezpieczenie roÅ›lin przed wektorami (insektycydy, oleje, folie fotoselektywne) - zabezpieczanie roÅ›lin przed mechanicznym zakażeniem (opryskiwanie inhibitorami infekcji) 8. Termoterapia ODPORNOŚĆ KRZYÅ»OWA (CROSS-PROTECTION) Odporność krzyżowa jest to naturalne zjawisko polegajÄ…ce na uodpornianiu roÅ›lin przez jeden izolat wirusa przeciwko drugiemu izolatowi tego samego wirusa. Jest zjawiskiem specyficznym, zachodzÄ…cym tylko pomiÄ™dzy bardzo pokrewnymi genetycznie izolatami tego samego gatunku wirusa. Praktyczne zastosowanie ochrony krzyżowej polega na celowym zakażaniu roÅ›lin izolatem Å‚agodnym (ochronnym) przeciwko izolatowi silnie patogenicznemu (konkurencyjny). CZYNNIKI WPAYWAJCE NA EFEKTYWNOŚĆ OCHRONY KRZYÅ»OWEJ 1. PokrewieÅ„stwo pomiÄ™dzy izolatami - im wiÄ™ksze pokrewieÅ„stwo genetyczne tym silniejszy i stabilniejszy efekt ochrony 2. Czas pomiÄ™dzy zakażeniami izolatem ochronnym i konkurencyjnym. 3. Koncentracja izolatu konkurujÄ…cego. 4. Zdolność izolatu konkurujÄ…cego do opóznionego przeÅ‚amywania odpornoÅ›ci. ODKAÅ»ANIE Obecnie, preparatom do dezynfekcji stawia siÄ™ coraz wiÄ™cej wymagaÅ„. Idealny dezynfektant powinien: *mieć szerokie spektrum dziaÅ‚ania, *wykazywać dużą szybkość dziaÅ‚ania, *wykazywać niskÄ… szkodliwość dla organizmów żywych, niebÄ™dÄ…cych obiektem zwalczania, *być nietoksyczny dla Å›rodowiska *wykazywać zdolność do biodegradacji, *nie powodować korozji dezynfekowanych materiałów, *nie zostawiać plam na dezynfekowanych powierzchniach, *nie zawierać szkodliwych lotnych skÅ‚adników chemicznych, *być Å‚atwo rozpuszczalny w wodzie i wysoko aktywny w wodzie niezależnie od jej jakoÅ›ci, *być aktywny w kontakcie z substancjami organicznymi, *wykazywać stabilność w formie cieczy roboczej. Ad. 2 ZMIENNOŚĆ WIRUSÓW Znajomość zróżnicowania populacji wirusa jest bardzo istotna z nastÄ™pujÄ…cych powodów: 1. Różne warianty (izolaty, szczepy) mogÄ… wykazywać różnÄ… szkodliwość. 2. MaÅ‚o popularne, ale bardzo szkodliwe izolaty prÄ™dzej lub pózniej bÄ™dÄ… Å‚amać odporność uzyskanÄ… metodami hodowli klasycznej lub inżynierii genetycznej. 3. Silne zróżnicowanie populacji izolatów jakiegoÅ› gatunku rzutuje na odpowiednie dopracowanie technik diagnostycznych. 4. Znajomość stopnia zróżnicowania izolatu pozwala na wyselekcjonowanie izolatu najbardziej Å‚agodnego na potrzeby indukowania odpornoÅ›ci krzyżowej. MECHANIZMY ZMIENNOÅšCI 1. BÅ‚Ä™dy w czasie replikacji genomu wirus nie posiada mechanizmów naprawczych. 2. Mutacje punktowe. 3. Rekombinacje wymiana odcinków genomów. 4. Pseudorekombinacje wymiana caÅ‚ych fragmentów u wirusów o genomach dzielonych. 5. Heteroenkapsydacja genom jednego wirusa jest opÅ‚aszczony kapsydem innego wirusa. 6. Komplementacja w infekcji mieszanej (kompleks) wirus niezdolny do produkcji ważnego biaÅ‚ka otrzymuje wsparcie od wirusa towarzyszÄ…cego. WYKAAD 7. 24.11.2014 1. Diagnostyka chorób wirusowych roÅ›lin a) metoda makroskopowa b) test biologiczny c) wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci fizyczne wirusów d) testy specjalne test rezorcynowy e) testy serologiczne f) test immunoenzymatyczny ELISA g) metody biologii molekularnej h) mikroskopia elektronowa B) Etapy testu biologicznego I. Dobór roÅ›lin testowych (wskaznikowych) II. przygotowanie zdrowych roÅ›lin testowych i posypanie ich proszkiem karborundowym III. przygotowanie inokulum (soku z roÅ›liny testowanej) IV. inokulacja mechaniczna i spÅ‚ukanie karborundu V. inkubacja VI. obserwacja objawów lokalnych i systemicznych C) Oznaczanie wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci fizycznych wirusa I. Termiczny punkt inaktywacji najniższa temperatura jakÄ… przez 10 min. należy dziaÅ‚ać na sok roÅ›liny chorej, aby wirus utraciÅ‚ wirulentność II. TrwaÅ‚ość in vitro okres przez jaki wirus jest zdolny do zachowania infekcyjnoÅ›ci poza roÅ›linÄ… III. Graniczny punkt rozcieÅ„czenia najmniejsze rozcieÅ„czenie soku z zainfekowanej roÅ›liny, w którym wirus traci swojÄ… wirulentność E) Testy serologiczne wykorzystuje siÄ™ tu antygenowe wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci wirusów. Antygen substancja wieloczÄ…steczkowa wprowadzona do ciaÅ‚a zwierzÄ™cia staÅ‚ocieplnego , wywoÅ‚ujÄ…ca reakcjÄ™ produkcji przeciwciaÅ‚. Kapsyd biaÅ‚kowy jest antygenem Reakcja aglutynacji = reakcja zlepiania siÄ™ G) Metody biologii molekularnej Technika Å‚aÅ„cuchowej reakcji polimeryzacji (polymerase chain reaction = PCR) Przy użyciu tej techniki można powielić fragment kwasu nukleinowego o znanej sekwencji nukleotydów z użyciem termostabilnej polimerazy. Polimeraza powiela Å‚aÅ„cuchy wykorzystujÄ…c wczeÅ›niej wytworzone startery = krótkie, kilkunastonukleotydowe fragmenty RNA, komplementarne do znanych fragmentów kwasu nukleinowego wirusa. Namnożone przy pomocy termocyklera odcinki kwasu nukleinowego poddaje siÄ™ rozdziaÅ‚owi elektroforetycznemu w żelu agarazowym. TechnikÄ™ PCR można stosować do wykrywania patogenów roÅ›lin oraz innych organizmów. 2. Ochrona roÅ›lin przed wirusami " unikanie zródeÅ‚ infekcji " stosowanie zdrowego materiaÅ‚u rozmnożeniowego: podkÅ‚adki, zrazy, oczka, sadzonki, bulwy, cebule, a także nasiona powinny pochodzić ze zdrowej, przetestowanej na obecność wirusów plantacji matecznej lub nasiennej " plantacje nasienne i mateczne powinny być zakÅ‚adane tylko z przetestowanego i caÅ‚kowicie wolnego od wirusów materiaÅ‚u wyjÅ›ciowego " plantacje powinny byÅ› poddawane okresowej kontroli, a roÅ›liny podejrzane o zawirusowanie należy usuwać z plantacji (selekcja negatywna) Ochrona ziemniaka: organizowanie rejonów zamkniÄ™tych produkcji sadzeniaków wykorzystywanie selekcji negatywnej roÅ›lin zwalczanie rizoktoniozy ziemniaka wczesne sadzenia podkieÅ‚kowanych lub pobudzonych bulw zwalczanie mszyc na wszystkich plantacjach w rejonie zamkniÄ™tym chemiczne niszczenie naci (Reglone) w momencie letniej migracji mszyc Oceny zdrowotnoÅ›ci ziemniaka: kwalifikacja polowa ocena weryfikacyjna poprzez obserwacje objawów chorobowych na pÄ™dach wyrastajÄ…cych z wyciÄ™tych oczek z prób bulw oraz poprzez wykonanie testu serologicznego ELISA Ochrona plantacji przed wektorami: zakÅ‚adanie plantacji w podÅ‚ożach wolnych od wektorów zwalczanie wektorów przenoszÄ…cych wirusy np. mszyce wirusy krążeniowe, inne wektory w glebie Stosowanie zwiÄ…zków hamujÄ…cych replikacjÄ™ analogi zasad azaguanina, tiouracyl Izolacja przestrzenna wirusy przenoszone z pyÅ‚kiem. Likwidacja samosiewów roÅ›lin uprawnych. WYKAAD 8 1.12.2014 1. Uprawa odmian odpornych Na wirusy: -GMO modyfikacje genem biaÅ‚ka okrywy -odmiany tolerancyjne Na wektory 2. Uwalnianie roÅ›lin od wirusów Hodowla z merystemów: -stożki wzrostu zwykle wolne od wirusów Termoterapia: -stosowanie podwyższonej temp. 37-42 °C na organy wegetatywne, po 3-6 tyg. odcinanie wierzchoÅ‚ków nowych pÄ™dów 3. Stosowanie przepisów kwarantannowych 4. Wiroidy sÄ… zbudowane z jednoniciowego kwasu rybonukleinowego Po raz pierwszy wiroida wyizolowaÅ‚ i opisaÅ‚ Diener w roku 1971. Najkrótszym jest wiroid żółtej plamistoÅ›ci awokado (Avocado sunblotun viroid, ASBVd) 246-247 nukleotydów NajdÅ‚uższym jest wiroid chlorotycznej pstroÅ›ci chryzantemy (Chrysanthemum chlorotic mottle viroid, CchMVd) 399-401 nukleotydów 5. W komórkach roÅ›lin RNA wiroidów przyjmujÄ…ce strukturÄ™ kolistÄ… (pozornie dwuniciowÄ…). Odcinki RNA sekwencji komplementarnych nukleotydów Å‚Ä…czÄ… siÄ™ ze sobÄ…, a odcinki sekwencji niekomplementarnych pozostajÄ… w postaci wolnych pÄ™tli. Struktura tzw. hairpin structure (struktura spinki do wÅ‚osów) jest charakterystyczna dla wiroida wrzecionowatoÅ›ci bulw ziemniaka i kilkunastu innych wiroidów zaliczanych do rodziny Pospiviroidae. 6. U innych wiroidów zaliczanych do rodziny Avsunoviroidae pozornie dwuniciowa struktura RNA tworzy jeszcze charakterystyczne rozgaÅ‚Ä™zienia tzw. hammerhead structure. 7. Wiroidy z rodziny Pospoviroidae namnażajÄ… siÄ™ w jÄ…drach zakażonych komórek roÅ›lin, a z rodziny Avsunoviroidae namnażajÄ… siÄ™ w chloroplastach. 8. Wiroidy nie sÄ… patogenami ukÅ‚adu translacyjnego. Pod wpÅ‚ywem wiroidów nie powstajÄ… biaÅ‚ka (np. replikaza, biaÅ‚ka pÅ‚aszcza) w komórce zbyta krótkie Å‚aÅ„cuchy RNA: 300/2/3=50 aminokwasów. SÄ… patogenami systemu transkrypcyjnego komórek roÅ›lin. Do transkrypcji wykorzystujÄ… enzymy wystÄ™pujÄ…ce w komórce żywiciela. 9. Wiroidy jako patogeny systemu transkrypcyjnego komórek roÅ›lin - faÅ‚szywe czynniki sygnaÅ‚owe RNA wiroida stanowi specyficzne sygnaÅ‚ dla zmiany przebiegu szlaków metabolicznych w komórkach roÅ›lin poprzez czÄ…steczki informacyjnego RNA (mRNA) komórkowego przenoszÄ…cego informacjÄ™ od genomowego DNA do rybosomów. Reakcja jest wzbudzana w cytoplazmie przez przemieszczajÄ…ce siÄ™ tam wiroidy, niezależnie od tego ,czy namnażajÄ… siÄ™ one w jÄ…drach komórkowych czy w chloroplastach. -inicjujÄ… proces potranskrypcyjnego wygaszania genów (PTGS) Mechanizm PTGS odpowiada za hamowanie ekspresji obcych genów w komórkach eukariotycznych. Przyczyna: kolista drugorzÄ™dowa struktura RNA wiroidów. 10. Transport wiroidów z komórki do komórki odbywa siÄ™ najprawdopodobniej przez plazmodesmy. DÅ‚ugodystansowy transport wiroidów przebiega floemem podobnie jak wirusów. Wiroidy znacznie Å‚atwiej niż wirusy zasiedlajÄ… tkanki merystematyczne. 11. Wiroidy * (+)ssRNA * 246-401 nukleotydów * obecne w jÄ…drach komórkowych * zasiedlajÄ… m.in. tkankÄ™ merystematycznÄ… * termofilne 25-32 °C * objawy: karÅ‚owatość, znieksztaÅ‚cenia, żółkniÄ™cie liÅ›ci * rozprzestrzenianie: organy wegetatywnego i generatywnego rozmnażania, nasiona, wieloletnie roÅ›liny zielne i drzewiaste 12. 2 rodziny: Pospiviroidae, Avsunoviroidae 8 rodzajów: 5 3 32 gatunki: 28 4 Wiroidy w Polsce - Potato spindle tuber viroid PSTVd wiroid wrzecionowatoÅ›ci bulw ziemniaka - Hop latent viroid HLWd utajony wiroid chmielu - Apple scar skin viroid ASSVd wiroid bliznowatoÅ›ci skórki jabÅ‚ek - Apple dapple viroid ADVd wiroid plamistoÅ›ci jabÅ‚ek - Peach latent viroid PLVd utajony wiroid brzoskwini 13. Ochrona roÅ›lin przed wiroidami -zdrowy materiaÅ‚ rozmnożeniowy -przestrzeganie przepisów kwarantannowych Dla oceny zdrowotnoÅ›ci materiaÅ‚u rozmnożeniowego i hodowlanego konieczne jest ich wykrywanie do czego wykorzystuje siÄ™ : * testy biologiczne * elektroforezÄ™ na żelach poliakrylamidowych (PAGE) * hybrydyzacjÄ™ z sondÄ… molekularnÄ… * reakcjÄ™ Å‚aÅ„cuchowÄ… polimerazy (PCR) Ponieważ wiroidy bardzo dobrze namnażajÄ… siÄ™ w roÅ›linach rosnÄ…cych w warunkach wysokiej temperatury, dlatego przy zamiarze uzyskania zdrowych sadzonek z chorych roÅ›lin konieczne jest utrzymanie tych roÅ›lin przy niskiej temperaturze (5°C), a nastÄ™pnie pobranie z nich fragmentu stożka wzrostu do uzyskania zdrowych roÅ›lin in vitro. Do wykrywania wiroidów nie stosuje siÄ™ metod serologicznych, ponieważ wiroidy nie zawierajÄ… biaÅ‚ek i w zwiÄ…zku z tym nie posiadajÄ… wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci antygenowych. Nie powodujÄ…, wiÄ™c powstawania specyficznych przeciwciaÅ‚ w organizmach zwierzÄ…t staÅ‚ocieplnych.