ĆWICZENIE 4
KINETYKA REAKCJI
ENZYMATYCZNEJ
61
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA Ćwiczenie 4
4. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ STAAA MICHAELISA
4.1. Podstawy teoretyczne
4.2. Wykonanie ćwiczenia
Podczas wykonywania poniższego ćwiczenia zamiast kolb miarowych stosujemy
probówki. Wykorzystując rozcieńczone roztwory można zaniedbać zjawisko kontrakcji
(popełniany błąd jest minimalny) i przyjąć, że suma objętości poszczególnych
roztworów stanowi całkowitą objętość roztworu.
Przed rozpoczęciem ćwiczenia studenci w grupie ustalają zakres czynności które będzie
wykonywał każdy z nich, ponieważ w trakcie wykonywania ćwiczenia należy dokładnie
kontrolować czas, którym wykonywane są poszczególne czynności.
A. Czynności wstępne
Student 1: Roztwór inwertazy
Drożdże świeże (0.5g) rozetrzeć w mozdzierzu z piaskiem, dodać 100ml wody
destylowanej, następnie przesączyć przez lejek zawierający niewielką ilość Celitu.
Pozostałość w zlewce i na lejku przemyć 100ml wody destylowanej. Supernatant,
zawierający inwertazę, stanowi materiał do ćwiczeń.
Student 2: Roztwory sacharozy o różnych stężeniach
Przygotować 100ml 0.2M roztworu sacharozy (M = 342 g/mol) w buforze octanowym.
Następnie należy przygotowany roztwór rozcieńczyć w krótkich probówkach według
poniższego schematu.
Rysunek 1
62
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA Ćwiczenie 4
Student 3: przygotowanie probówek z 10% roztworem NaOH (do zakończenia reakcji)
Przygotować 20 suchych, długich probówek i do każdej wprowadzić 2ml 10% r-ru
NaOH. Probówki opisać zgodnie z poniższym schematem:
Rysunek 2
B. Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej
Student 1: Krzywa kalibracji
Do 5 długich probówek wprowadzić podane niżej objętości poszczególnych roztworów,
a następnie każdą probówkę poddać inkubacji przez 5 minut we wrzącej łazni wodnej.
Po tym czasie zmierzyć wartość absorbancji (A) przy = 530nm wobec próby kontrolnej
(nr 0) (pomoc asystenta). Wyniki pomiarów zamieścić w tabeli.
Tabela 1
Nr V V V V A C
wz buforu NaOH (10%) kw.pikr. 530 glukozy-fruktozy
probówki [ml] [ml] [ml] [ml] [g*dm-3]
0 0.0 1.0 2.0 2.0
1 0.2 0.8 2.0 2.0
2 0.4 0.6 2.0 2.0
3 0.6 0.4 2.0 2.0
4 0.8 0.2 2.0 2.0
5 1.0 0.0 2.0 2.0
63
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA Ćwiczenie 4
Student 2 i Student 3: Badanie kinetyki reakcji (wykonanie doświadczenia)
Każdy ze studentów wykonuje pomiar dla dwóch stężeń sacharozy (roztwory wcześniej
przygotowane przez Studenta 2)
Do 4 probówek należy odmierzyć po 3ml wcześniej przygotowanych roztworów
sacharozy o różnym stężeniu (przygotowanych wcześniej przez Studenta 2) dodać 3ml
supernatantu zawierajÄ…cego enzym (przygotowanego przez Studenta 1). Natychmiast
po wymieszaniu pobrać 1 ml roztworu z każdej probówki i dodać do odpowiednio
oznaczonej probówki zawierającej 2ml 10% r-ru NaOH (t = 0) oraz dokładnie
wymieszać. Kolejne próbki należy pobrać po upływie 3, 7, 12 i 20 minut. Następnie do
wszystkich roztworów należy dodać 2ml r-ru kwasu pikrynowego. Wszystkie probówki
poddać inkubacji 5 minut we wrzącej łazni wodnej.
Rysunek 3
64
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA Ćwiczenie 4
Rysunek 3 cd
Pomiar absorbancji dla poszczególnych próbek wykonuje Student 1 zaraz po tym gdy
cała seria dla danego stężenia jest gotowa.
Dla każdej próby wykonać pomiar absorbancji (A) przy = 530nm wobec próby
kontrolnej (t = 0). Wyniki pomiarów zamieścić w poniższej tabeli.
Tabela 2
nr. C Absorbancja (A) po czasie t [min]
n
r-ru [mol*dm-3] 3 7 12 20
1 0.2
2 0.1
3 0.05
4 0.025
65
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UA Ćwiczenie 4
Po zakończeniu swoich czynności należy dokładnie umyć sprzęt wielokrotnego użytku
umyć wodą z płynem do mycia (zmazać oznaczenia), wodą oraz acetonem i wysuszyć w
suszarce.
4.3. Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej
(przygotowanie sprawozdania)
·ð Napisanie równaÅ„ reakcji przeprowadzanych podczas doÅ›wiadczenia (hydroliza
sacharozy, reakcja glukozyz kwasem pikrynowym: bilans jonowo-elektronowy
reakcji redoks).
·ð Zamieszczenie uzupeÅ‚nionych tabel 1-3. Z krzywej wzorcowej należy odczytać
stężenie [g*dm-3] glukozy-fruktozy odpowiadających poszczególnym wartościom
absorbancji.
Tabela 3
nr. C C [g*dm-3]
n glukozy-fruktozy
r-ru [mol*dm-3] 3 7 12 20
1 0.2
2 0.1
3 0.05
4 0.025
·ð SporzÄ…dzenie wykresów dla każdego ze stężeÅ„: C = f(t) (4 wykresy).
glukozy-fruktozy
Wyznaczenie v dla każdego ze stężeń (tangens kąta nachylenia stycznej do wykresu
0
C = f(t) w punkcie t = 0).
glukozy-fruktozy
v = tg Ä… = x/y = c/t [g*dm-3*min-1]
0
·ð WykreÅ›lenie krzywej Michaelisa- Menten (zależność v = f(C ) ).
0 substratu
·ð Wyznaczenie z wykresu Michaelisa-Menten staÅ‚ej K (stężenie substratu, przy którym
m
szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę wartości szybkości maksymalnej
½*v ).
max
·ð WykreÅ›lanie prostej Lineweavera- Burka (1/v = f(1/C ) ).
0 substratu
·ð Wyznaczenie staÅ‚ej Miachaelisa (K ) z prostej Lineweavera Burka
m
(tg ą = K /v ; w punkcie przecięcia prostej z osią rzędnych można odczytać wartość
m max
1/ v , natomiast w punkcie przecięcia z osią odciętych wartość 1/K ).
max m
Uwaga:
W sprawozdaniu należy umieścić wszystkie wzory wykorzystywane podczas obliczeń,
obliczenia itp.
66
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
cwiczenie 4 inwertaza kinetyka reakcji enzymatycznych 05 05 2014wyklad 3 KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCHKinetyka reakcji enzymatycznychENZYMY KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCHcwiczenie 2 hydrolazy czynniki wplywajace na szybkosc reakcji enzymatycznych 05 05 20144 Kinetyka reakcjikinetyka reakcji chemicznychKINETYKA REAKCJI zadania dodatkowe 2BADANIE KINETYKI REAKCJI HYDROLIZY SACHAROZY KATALIZOWANEJ PRZEZ INWERTAZĘ Z DROŻDŻYCwiczenie nr Kinetyka chemiczna Czynniki wplywajace na szybkosc reakcji chemicznychW7 KINETYKA SZYBKOSC REAKCJI ROWNOWAGACwiczenie 3 Reakcje nieemzymatycznego brunatnienia zywnoscićwiczenie2 reakcje grup funkcyjnychwięcej podobnych podstron