Kultury Tkankowe Zwierzęce
i Roślinne
Biotechnologia, Semestr 7
Wykład 1
Wprowadzenie do hodowli komórek i tkanek;
Historia, rodzaje hodowli, linie komórkowe,
podłoża hodowlane
maria.widel@polsl.pl
Materiały i literatura przedmiotu
" Hodowla komórek i tkanek
pod redakcją Stanisławy Stokłosowej , Wyd. PWN,
Warszawa 2004
" Wykłady i laboratoria
" Podstawa zaliczenia:
- Zaliczenie ćwiczeń laboratoryjnych
- Kolokwia bieżące w czasie laboratoriów
- Kolokwium zaliczeniowe z całości materiałów
po zakończeniu wykładów
Tematy wykładów
" 1. Wprowadzenie do hodowli komórek i tkanek, organizacja
pracowni hodowli komórek i tkanek, sprzęt, aparatura,
drobne wyposażenie; definicje, pasażowanie komórek linii
ustalonych
" 2. Linie komórkowe, typy hodowli, zakładanie hodowli
pierwotnych, pasażowanie, bankowanie
" 3. Hodowle komórkowe w badaniach biologicznych: metody
analizy w toksykologii: testy klonogenne, barwienie
przyżyciowe, aktywność metaboliczna
" 4. Hodowle komórkowe w badaniach biologicznych: metody
analizy genotoksyczności (test mikrojądrowy, analiza
wymiany chromatyd siostrzanych, badanie pęknięć nici DNA)
Tematy wykładów c.d
" 5. Hodowle komórkowe w badaniach biologicznych:
metody analizy apoptozy i nekrozy
" 6. Hodowle narządowe (hodowle organotypowe)
" 7. Komórki macierzyste: hodowle, potencjalne
wykorzystanie w medycynie
Tematy wykładów c.d.
" 8. Hodowle komórkowe w immunologii: w produkcji
przeciwciał monoklonalnych
" 9. Hodowle komórkowe w immunologii: w procesie
produkcji szczepionek przeciwwirusowych
" 10. Hodowle komórkowe w terapii genowej; wytwarzanie
leków metodami inżynierii genetycznej
Tematy wykładów c.d
" 11. Pozaustrojowe uzyskiwanie zarodków ssaków;
hodowle komórek rozrodczych
" 12. Hodowle komórek roślinnych
Uwaga: tematy wykładów nie muszą pojawić się w podanej
kolejności
Kolkwium zaliczeniowe
Tematy ćwiczeń laboratoryjnych
" 1. Hodowle komórek utrwalonych linii; zapoznanie się ze
sprzętem i aparaturą, opanowanie zasad przygotowania podłóż i
prowadzenia hodowli, wykonanie pasażu komórek
" 2. Klonogenne systemy testowe (opis testu - teoretyczny;
posiewanie ilościowe komórek)
" 3. Ocena przeżywalności/proliferacji komórek klonogennych
rosnących w postaci przywartej do podłoża, liczenie kolonii
praktyczne)- sprawozdanie na zaliczenie
" 4. Ocena pęknięć pojedynczej i podwójnej nici DNA oraz
uszkodzeń oksydacyjnych metodą elektroforezy pojedynczych
komórek w żelu agarozowym ( metoda kometowa ) wykonanie
elektroforezy. Kolokwium zaliczeniowe z dotychczasowego
materiału z ćwiczeń i wykładów
" 5. Mikroskopowa rejestracja i analiza komet lub analiza
zarejestrowanych wcześniej komet sprawozdanie na zaliczenie
" 6. Test mikrojądrowy (opis testu - teoretyczny ; mikroskopowa
ocena preparatów uzyskanych z hodowli napromieniowanych
komórek praktycznie). Kolokwium zaliczeniowe końcowe
Hodowla tkanek
Jest to metoda umożliwiająca utrzymanie in vitro w stanie żywym
i sprawnym metabolicznie komórek, fragmentów tkanek
(eksplantów), lub narządów co najmniej przez 24 godz.
Należy rozróżnić pojęcia hodowla tkanek i hodowla komórek:
Nazwa hodowla tkanek powinna obejmować: hodowle
przestrzenne, narządowe, modele i konstrukty tkanek i narządów
(n.p. skóry).
Nazwa hodowla komórek faktycznie powinna dotyczyć hodowli
komórek wyizolowanych z tkanek (dyspersyjnych), zarówno
hodowli pierwotnych jak i ustalonych i ciągłych linii
komórkowych.
Hodowla wycinka tkanki nerwowej w kropli wiszącej
(Ross Harrison)
Historia hodowli tkanek
" Faktyczne początki hodowli tkanek stworzył Ross.G.Harison w
1907 r. Hodował w kropli surowicy wycinki (eksplanty) tkanki
nerwowej żaby; obserwował wzrost aksonów.
Zakończenie aksonu
Zakończenie
aksonu
perykarion
Oligodendrocyt
Komórka Schwanna;
Lemocyt
(Neuryt)
(Neuryt)
Jądro komórki
Komórka nerwowa (neuron, neurocyt); Wielkość; kilka -120 mm;
akson do 50 cm
Historia hodowli tkanek c.d.
" Kilka lat pózniej (1910) chirurg francuski, Alexis Carrel
wprowadził zasady aseptyki (jałowego pobierania wycinków
tkanek, używanie sterylizowanego szkła i pożywek, pracę w
wysterylizowanych boksach).
" Tworzył on pierwsze podłoża do hodowli wycinków tkanek
przez mieszanie plazmy krwi kurzej z płynem zarodkowym
embrionów kurzych.
" Zaprojektował i wprowadził
do hodowli specjalne szklane
naczynia, tzw. naczyńka Carrela.
Współcześnie używana do hodowli komórek butelka
(cell culture flask)
Hodowla pierwotna: zapoczątkowana pobraniem komórek
lub tkanek bezpośrednio z organizmu (dyspersja tkanki;
niejednorodna populacja, np. komórki nowotworowe
zanieczyszczone głównie fibroblastami)
Linia komórkowa (ustalona): powstaje przez przeniesienie
części hodowli pierwotnej do odrębnej hodowli. Jeżeli materiał
daje się potem wielokrotnie przenosić ("pasażować") do
kolejnych hodowli, mówimy o tzw. ustalonej linii komórkowej.
Tożsamość komórek musi być potwierdzona testami
immunocytochemicznymi)
Klon komórkowy: jest to populacja komórek wywodząca się z
jednej komórki macierzystej i powstała na drodze jej
wielokrotnych podziałów.
" Linie ustalone (established cell lines):
- ciągłe (ang. permanent line, continuous cell lines): komórki
nowotworowe, unieśmiertelnione linie komórek normalnych
(przez spontaniczną transformację lub transfekcję, np. SV40)
- linie o ograniczonym czasie przeżycia (np. fibroblasty*,
keratynocyty*)
* Linie komórek wyprowadzone z płodu żyją znacznie dłużej niż
wyprowadzone z organizmu dorosłego
Klon komórek (kolonia) wywodzących się z jednej komórki
wyjściowej. Obraz z mikroskopu świetlnego odwróconego ,
oryginalne powiększenie 400x
Podłoża hodowlane
" Pożywki (media) podstawowe:
" BME, basal medium Eagle s,
" MEM, minimal Eagle s medium
" DMEM, Dulbecco modified Eagle s medium
" RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute)
" Pożywki wzbogacone (przystosowane do hodowli niektórych
linii komórkowych:
" DMEM / F12 HAM
" Mc Coy
" HAM F10
" TCM 199 (pożywka Parkera)
Skład pożywek hodowlanych
" Zbuforowane płyny fizjologiczne (sole mineralne utrzymujące
odpowiednie ciśnienie osmotyczne i pH); Earle s balance salt
solution, EBSS; bufor fosforanowy, PBS (DPBS); Hanks
balanced salt solution, HBSS); dodatkowo regulacja pH za
pomocą NaHCO3 i HEPES (<20mM)
" yródło energii: glukoza, niekiedy fruktoza, galaktoza i glutamina
(stymuluje produkcję ATP)
" Aminokwasy (także peptydy i białka: fibronektyna, transferyna,
albumina, alfa-, gamma globuliny)
" Witaminy (szczególnie z grupy B)
" mikroelementy (Zn, Cu, Se, Fe)
" Hormony i czynniki wzrostowe
" Kwasy tłuszczowe
Zbuforowane roztwory soli (roztwory fizjologiczne)
Sole wapnia i magnezu
Pierwsze płyny hodowlane (podtrzymujące)
Pierwsze płyny hodowlane (podtrzymujące)
c.d.
Liquid Powder
c.d.
DMEM cd
Suplementy - zalety i ograniczenia
" Surowica płodowa (fetal /foetal calf serum, FCS; fetal bovine
serum, FBS); surowice z dojrzałych zwierząt: końska, świńska,
kozia, królicza, jagnięca, ludzka
- mitogeny np. PDGF, EGF, IGF, VEGF (proliferacja komórek i/lub
różnicowanie)
- hormony: insulina, hydrokortyzon (może działać mitogennie i
cytostatycznie)
- albuminy (białka nośnikowe dla lipidów, witamin, wiąże jony
metali ciężkich, działa buforująco i ochronnie)
- kwasy tłuszczowe
- transferyna (przenosi żelazo)
- czynniki adhezyjne (fibronektyna, kollageny, laminina, fetuina)
- inhibitory proteaz (globuliny a-antytrypsynowe, makroglobuliny a)
- TGF-b
Surowica - ograniczenia
- Różnice składu pomiędzy seriami (sprawdzanie każdej serii)
- Ryzyko zakażenia wirusami, mykoplazmą
- Ryzyko przeniesienia prionów gąbczastego zwyrodnienia mózgu
(bovine spongiform encephalopathy, BSE, choroba Creutzfeldta-
Jakoba) w przypadku prowadzenia hodowli na użytek kliniczny !
Na pewno wolna od BSE jest surowica nowozelandzka i
australijska, (tam nie wystąpiło BSE)
inne muszą być testowane!
- Najczęściej potrzebna jest inaktywacja termiczna (56oC, godz),
(inaktywuje nadmiar immunoglobulin i czynniki dopełniacza, nie
niszczy czynników wzrostowych ?)
Choroby prionowe- zakazne gąbczaste encefalopatie
(transmissible spongiform encephalopaties)
" U człowieka: CJD (Creutzfeldt-Jakob disease)
" U bydła: BSE (bovine spongiform encephalopaty)
" U owiec: scrapie (choroba kłusowa, trzęsawka)
" Czynnikiem zakaznym jest zmutowane białko PrPsc
(prawidłowe białko PrPc)
Zmutowane białko PrPsc jest oporne nawet na temp.
360oC, oporne na denaturację alkoholową aldehydową,
enzymy trwienne, proteazy.
Białko PrPsc pojawia się w różnych tkankach, ale
najwięcej w mózgowiu i w śledzionie, powodując
destrukcję komórek
Możliwe przeniesienie międzygatunkowe (?)
Metryczka dołączona do surowicy musi zawierać:
Numer katalogowy i nazwę firmy
Żródło pochodzenia (kraj, kontynent)
Datę produkcji
Datę ważności
Wykonane testy w kierunku BSE i infekcji
wirusowych!
(a) Skażenie bakteryjne, hodowli (b) Skażenie drożdżakami
Skażenie hodowli pleśniami (grzybami)
(d) Wzrost mikoplazmy na specjalnym agarze (makroskopowo);
(b) Kolonie mikoplazmy widziane w mikroskopie skaningowym
(g)
Mikoplazma rosnąca na powierzchni zainfekowanych komórek;
(f) elektronowy mikroskop skaningowy, (g) mikroskop świetlny
Zainfekowana wirusem komórka najczęściej
ginie z powodu:
1. Zahamowania ekspresji genów będącej wynikiem
integracji genomu wirusa z genomem komórki
2. Syntetyzowania kwasu nukleinowego wirusa i białek dla
kapsydu
3. Zmian metabolicznych wywołanych ekspresją
dodatkowej informacji genetycznej
4. Wyczerpania komórki
W zainfekowanej wirusem komórce in vitro zachodzą
zmiany cytopatyczne (cytopatogenne):
1. Utrata kształtu wielokątnego i wypustek, zaokrąglenie
1. Utrata adhezji, oderwanie od podłoża
2. Pęknięcie błony i liza komórki, lub apoptoza
3. Fuzja komórek (błony zlewają się, powstaje wielojądrowe
syncytium)
4. Tworzą się tzw. ciałka inkluzyjne zawierające cząstki
wirusowe
Pożywki bez surowicy (serum free media, SFM)
" Podłoża o zmniejszonej zawartości surowicy stosuje się w
hodowlach pierwotnych (nie zawsze) lub ze względu na
wymagania eksperymentów
" substancje zastępcze: albuminy i alfa-globuliny (wyosobnione
frakcje najczęściej z surowicy cieląt)
" czynniki wzrostu, np. EGF, KGF (keratynocyty-fibroblasty,
wzajemna stymulacja), FGF (wiążą się z receptorami na
komórkach
" Hormony (insulina, estrogeny)
Podłoża selektywne np.
eliminujące fibroblasty,
pożywki pobudzające różnicowanie komórek
Wady:
Pożywki bez surowicy są droższe niż standardowe
Wzrost komórek jest wolniejszy
Inkubatory dla hodowli w pożywkach bez surowicy
powinny zawierać atmosferę z 10% CO2 ( z surowicą 5%)
" Niekiedy konieczne jest powlekanie powierzchni
sztuczną macierzą pozakomórkową ECM (kolagen,
fibronektyna, laminina, vitronektyna), np. hodowle
pierwotne;
" ECM nie tylko ułatwia przyleganie komórek;
czynniki te wiążą się z receptorami powierzchniowymi
komórek, co uruchamia sygnały pobudzające
proliferację komórek, ale także różnicowanie
Hodowla ustalonych linii komórek adherentnych
(wzrost typu monolayer) - protokół
" Odbankowanie (szybkie rozmrożenie w pojemniku z
wodą ~37oC, w cieplarce)
" Odwirowanie komórek dla usunięcia medium
konserwującego (czasem lepiej nie wirować!)
" Zawieszenie komórek w odpowiednim medium do
hodowli
" Ewentualne barwienie przyżyciowe i ocena żywotności
komórek w komorze do liczenia (r- r błękitu trypanowego,
erytrozyny B)
" Wysiewanie do naczynia hodowlanego (butelki, płytki)
" Kontrola w mikroskopie odwróconym
" Po kilku dniach dokonuje się przeszczepu (pasażu) na
nowe naczynia hodowlane
Adhezja komórek
" Wczesna adhezja, early adhesiveness (komórki przylegają
lecz nie rozprzestrzeniają się)
" Pośrednia adhezja, intermediate adhesiveness (komórki
rozprzestrzeniają się; brak wypustek i kontaktu
ogniskowego - focal adhesion)
" Pózna adhezja, late adhesiveness (rozprzestrzenianie,
widoczne wypustki włókienkowe i ogniskowy kontakt
adhezyjny)
Podobny mechanizm migracji działa w warunkach in vitro
tworzy się ogniskowy (punktowy) kompleks adhezyjny przy
udziale białek: integryn, aktyny, vinkuliny, paxiliny i tensyny
Zależność adhezji od wielkości inoculum
" % I max jest miarą maksymalnej liczby komórek, które
przywierają do podłoża wyrażoną w procentach wielkości
inoculum (ilości komórek posiewanych). Nie wszystkie komórki
z danego inokulum zdolne są do adhezji !
k-szybkość proliferacji
td czas podwojenia
komórek
t1/2 połowa czasu
niezbędnego do uzyskania
%I max
Kinetyka wzrostu komórek w hodowli
Faza lag = faza
opóznienia
(czas adhezji)
Pasażowanie/przeszczepianie komórek adherentnych-
ćwiczenie laboratoryjne nr 1
" Pasażu dokonuje się przed uzyskaniem całkowitej
monowarstwy (80% konfluencji, wykładnicza faza wzrostu)
1. Usuwa się pożywkę z naczynia hodowlanego i przepłukuje
hodowlę małą ilością roztworu trypsyny (1-2 ml), usuwając
komórki nieprzywarte i resztki pożywki
2. Hodowlę zadaje się 1-2 ml r-ru trypsyny i inkubuje się w
cieplarce (~3 min) do odklejenia się komórek, lub w
temperaturze pokojowej
3. Przerywa się działanie trypsyny dodając 1-2 ml pożywki
4. Ewentualne agregaty komórek rozprasza się przez kilkakrotne
dość energiczne pipetowanie
5. Zawiesinę rozdziela się w zależności od potrzeb do nowych
butelek inokulując więcej lub mniej komórek (1:1, 1:2, 1:4 itp.)
6. Dodaje się odpowiednią ilość świeżego medium hodowlanego
" Ewentualne barwienie przyżyciowe i ocena żywotności
komórek (błękit trypanowy, erytrozyna B, mikroskop świetlny
" Kontrola w mikroskopie odwróconym
Nieliczne komórki przywarte do dna butelki w kilka
godzin po posianiu widziane w mikroskopie z
kontrastem fazowym (nie barwione);
Nieliczne komórki przywarte do dna butelki w kilka
godzin po posianiu widziane w mikroskopie z
kontrastem fazowym (nie barwione);
Komórki nowotworowe 24 godz. po przeszczepie
Kilkudniowa hodowla komórek nowotworowych (prawie
100% zagęszczenie/konfluencja) widziane w mikroskopie
z kontrastem fazowym (nie barwione);
Komórki fibroblastów ludzkich w hodowli widziane w
mikroskopie z kontrastem fazowym (nie barwione);
hodowla co najmniej tydzień po przeszczepie,
stłoczona (wejście w fazę stacjonarną)
Fibroblasty komórki występujące w różnego typu
tkance łącznej
Przykład tkanki łącznej
Fibroblasty ludzkie linii NHDF w hodowli. Kontrast-fazowy,
oryginalne powiększenie 600x
Komórki raka jelita grubego linii HCT116 . Mikroskop
odwrócony, oryginalne powiększenie 200x
Fibroblasty ludzkie linii NHDF w hodowli. Utrwalone na płytce,
wybarwione barwnikiem fluorescencyjnym (DAPI), mikroskop
fluorescencyjny Axiophot, powiększenie 400x
Komórki białaczki szpikowej linii K562 rosnące w zawiesinie
(mikroskop odwrócony)
Bankowanie komórek
" Komórki zabankowane w odpowiednim podłożu mogą być
przechowywane przez wiele lat (w parze ciekłego azotu, -196oC)
" Medium krioprotekcyjne (n.p. 70% surowicy, 15%DMSO, 15%
odpowiedniego dla danej linii); zamiast DMSO glicerol
" Temperatura schładzania ~1oC/min
(<2 h w temp -20oC, 24 h w - 70oC, w -196oC wiele miesięcy i lat)
" Gęstość komórek do mrożenia 106-107/ml
" Transport komórek zabankowanych suchy lód (zamrożony
CO2, temp. -78oC)
Kwarantanna
Każda nowa linia jaką wprowadzamy do pracowni
hodowlanej powinna być poddana kwarantannie, tzn.
hodowana oddzielnie, a następnie poddana testom na
obecność mykoplazmy.
Podobnie ostrożnie należy postępować z materiałem
ludzkich tkanek (wycinków, biopsji).
Technika zliczania komórek w komorze Brkera
(hemocytometrze)
Wygląd zewnętrzny
hemocytometru
(komory Brkera,
komory Neubauera)
siatka
Zautomatyzowane liczenie liczniki komórek (cell counter)
Wygląd siatki w komorze Brkera
Siatka komory Brkera liczenie komórek
Czerwonych nie liczymy!
Liczymy komórki w 5 kwadratach ograniczonych potrójnymi liniami w
obu siatkach komory (czyli w 10 kwadratach, których objętość w sumie
wynosi 1l), a zatem:
Suma komórek z 10 kwadratów x 1000 = liczba komórek w 1 ml
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Wykł 2 Kult 2010 Wprowadzenie2Wykł 6 Kult 2010 Zastos hodowli w bad podst, immun, farmakologii i medycynieWykł 5 Kult 2010 Zapłodnienie in vitroWykł 7 Kult 2010 Hod kom wybranych organów i tkanke, inżynieria tkankowa, med regeneracyjnawykl teoria sprezystosci wprowadzenieWprowadzenie do psychologii wykł UGwprowadzenie do pedagogiki ćw 24 10 2010wykl wprowadzenieWprowadzenie OECD 2010 wykłady 02 20 v 1 02009 2010 rejonWYKŁAD 1 Wprowadzenie do biotechnologii farmaceutycznejwprowadz w11Instrukcja F (2010)OTWP 2010 TEST IIIwięcej podobnych podstron