Kwas cytrynowy
Kwas cytrynowy (2-hydroksyl,2,3-propanotrikarboksylowy) o Mcz=192 i temperaturze topnienia
153癈 po raz pierwszy zostal wyizolowany z soku cytryn. Wystepuje w postaci bezwodnej lub
jedno wodnej. Jednowodna forma kwasu cytrynowego otrzymywana jest przez krystalizacje w
temperaturze ponizej 36,6癈, powyzej tej temperatury powstaje forma bezwodna. Kwas cytrynowy
jest mocnym kwasem organicznym, o czym decyduja stale dysocjacji wynoszace w 18癈
odpowiednio, K1=8,7x10-4, K2=1,77xl0-5,K3=1,0xl0-7. Rozpuszczalnosc w wodzie w temperaturze
20癈 wynosi 73,3 g/100 cm3, w alkoholu w temperaturze 15癈 75,91 g/100 cm3. Kwas cytrynowy
otrzymywany jest wylacznie na drodze biologicznej z substrat贸w naturalnych odtwarzalnych
(pochodzenia roslinnego), co miedzy innymi decyduje o oplacalnosci produkcji. Swiatowa
produkcja kwasu cytrynowego przekracza 300 000 ton rocznie, jej rozmiary podyktowane sa duzym
zapotrzebowaniem na ten kwas, gl贸wnie, bo az w 80%, przez przemysl spozywczy, lecz takze
farmaceutyczny, chemiczny i metalurgiczny. Szerokie wykorzystanie kwasu cytrynowego w
przemysle spozywczym wynika z jego dzialania konserwujacego na skutek obnizania wartosci pH
srodowiska. Jest jednoczesnie zwiazkiem nietoksycznym, o dobrych cechach smakowych i
zapachowych. Gl贸wnie z tych wzgled贸w kwas cytrynowy zostal dopuszczony przez FAO/WHO
bez ograniczen do produkcji zywnosci. Kwas ten stosowany jest w przemysle owocowo-
warzywnym jako inaktywator enzym贸w (oksydaz), kt贸re odpowiedzialne sa za utlenianie zwiazk贸w
fenolowych, powodujacych ciemnienie owoc贸w i warzyw. Wykorzystywany jest r贸wniez do
produkcji napoj贸w, slodyczy, owoc贸w kandyzowanych, a takze w produkcji win, jako preparat
zakwaszajacy i stabilizujacy. Tworzenie przez kwas cytrynowy kompleksowych polaczen z jonami
metali (Fe,Cu, Zn) zadecydowalo o jego szerokim zastosowaniu jako stabilizatora (antyoksydanta)
olej贸w. Poprzez wiazanie metali katalizujacych proces jelczenia tluszcz贸w, kwas cytrynowy
przerywa reakcje tworzenia nadtlenk贸w i innych produkt贸w powstalych w wyniku utleniania
nienasyconych kwas贸w tluszczowych w procesie autooksydacji olej贸w.
Wlasciwosci tworzenia kompleks贸w z metalami ciezkimi wyznaczylo szeroki obszar wykorzystania
kwasu cytrynowego do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem
powlokami ochronnymi. W przemysle farmaceutycznym stosowany jest jako dodatek do tabletek,
powodujac musujacy efekt podczas ich rozpuszczania w wodzie. Ponadto cytrynian trisodowy i
tripotasowy uzywany jest w Stacjach Krwiodawstwa jako preparat zapobiegajacy krzepnieciu krwi.
W technologiach chemicznych kwas cytrynowy, a zwlaszcza jego sole (np.cytrynian trisodowy),
znalazly szerokie wykorzystanie w chemii gospodarczej wypierajac trudno biodegradowane
fosforany ze skladu detergent贸w. Estry kwasu cytrynowego i alkoholi alifatycznych, np. ester
trietylowy, tributylowy, znalazly zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w masach
plastycznych, z kt贸rych wytwarza sie cienkie powloki (filmy) ochraniajace zywnosc. Wodne 24%
roztwory kwasu cytrynowego stosowane sa w mleczarstwie do usuwania z aparatury tzw. kamienia
mlecznego, tj. osadu utworzonego z bialka, tluszczu i soli mineralnych mleka. Producentami kwasu
cytrynowego sa wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, Aspergillus wentii oraz liczne
drozdze z rodzaju Candida (Candida lipolytica, Candida tropicalis, Candida intermedia), kt贸re
syntetyzuja kwas cytrynowy w srodowiskach zawierajacych n-alkany. Wsr贸d szczep贸w z gatunku
Candida lipolytica zostal wyselekcjonowany szczep, u kt贸rego stwierdzono cykl plciowy, co
odr贸znialo go od innych. W 1972 roku Yarrow na podstawie szczeg贸lowych badan wskazujacych
na wiele unikalnych cech dotyczacych morfologii askospor nadal mu nazwe Yarrowia lipolytica.
Gatunek ten wyr贸znia sie szczeg贸lna wlasciwoscia syntetyzowania kwasu cytrynowego z n-parafin,
co stawia go w szeregu cennych szczep贸w przemyslowych.
W praktyce przemyslowej najwieksze znaczenie maja jednak szczepy Aspergillus niger. Proces
produkcyjny jest prowadzony metoda powierzchniowa LFS (ang. Liquid Surface Fermentation),
wglebna SmF (ang. Submerged Fermentation) oraz na pozywkach stalych, tzw. proces SSF (ang.
Solid State Fermentation). Ta ostatnia metoda najpowszechniej rozwinela sie w Japonii, gdzie 20%
ilosci kwasu cytrynowego wytwarzanego na drodze biologicznej pochodzi z procesu na podlozu
stalym. W metodzie tej surowcem moga byc otreby, wytloki z trzciny cukrowej (o wilgotnosci nie
mniejszej niz 40%), wadliwa melasa buraczana czy trzcinowa, kt贸ra z uwagi na niewlasciwy sklad,
w tym obecnosc zwiazk贸w toksycznych, nie mogla byc wykorzystana w pozostalych metodach. Ze
wzgledu na mozliwosc wykorzystania jako pozywek r贸znego rodzaju odpadowych surowc贸w
roslinnych oraz mniejsze obciazenie sciekami, technologia ta spelnia warunki ekologiczne i w
ostatnich latach nabywa szczeg贸lnego znaczenia. Na podkreslenie zasluguje fakt, ze w tym procesie
nie potwierdza sie wiele mechanizm贸w wystepujacych w tradycyjnych sposobach otrzymywania
kwasu cytrynowego, np. wystepuje wyzsza tolerancja grzybni Aspergillus niger na stezenie w
podlozu jon贸w metali i mikroelement贸w. Inna metoda, z kt贸ra zwiazana jest przyszlosc produkcji
kwasu cytrynowego, to hodowla ciagla i stosowanie immobilizowanych kom贸rek grzybni
Aspergillus niger. Obecnie w swiatowej produkcji kwasu cytrynowego metoda wglebna jest
wiodaca i tylko okolo 30% kwasu otrzymywanego jest jeszcze metoda powierzchniowa.
Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego
Szczepy Aspergillus niger stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego otrzymane
zostaly w wyniku mutagenizacji oraz skriningowych selekcji szczep贸w naturalnych. Techniki te,
mimo iz naleza do najstarszych, wciaz przynosza dobre rezultaty. W charakterze mutagen贸w
stosowane sa czynniki fizyczne, w tym gl贸wnie promieniowanie ultrafioletowe (o dlugosci fali
=260 nm), chemiczne lub kombinacje obu tych grup. Selekcja szczep贸w po dzialaniach
mutagennych prowadzona jest wedlug kryterium przyszlego zastosowania. Praktyka wykazala
bowiem, ze szczepy zapewniajace wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego w procesie wglebnym na
podlozu mineralnym nie sprawdzaja sie w procesie powierzchniowym na podlozu melasowym.
Przyczyna tego jest zbyt bogata zawartosc w melasie buraczanej skladnik贸w mineralnych i
stymulator贸w wzrostu w postaci zwiazk贸w azotowych i fosforowych, co powoduje nadmierny
rozw贸j biomasy grzybni przy jednoczesnie oslabionej biosyntezie kwasu cytrynowego. Ulepszanie
szczep贸w Aspergillus niger do produkcji kwasu cytrynowego mozliwe jest takze w oparciu o
metody rekombinacji genetycznej, w kt贸rych podstawowe znaczenie ma istnienie u plesni cyklu
paraseksualnego, umozliwiajacego przeprowadzenie hybrydyzacji i selekcje rekombinant贸w.
Doskonalenie szczep贸w do produkcji kwasu cytrynowego prowadzone jest na drodze fuzji
protoplast贸w miedzy odmianami Aspergillus niger r贸zniacymi sie wydajnoscia kwasu
cytrynowego, szybkoscia fermentacji czy tolerancja na skladniki podloza, celem otrzymania
szczep贸w o korzystnych cechach technologicznych. Istnieje mozliwosc tworzenia
miedzyrodzajowych fuzant贸w, np. pomiedzy Aspergillus niger i Trichoderma viride, wykazujacych
opornosc na analog glukozy, 2-deoksy-D-glukoze (tworzacy sie w srodowisku hodowlanym i
dzialajacy jako inhibitor enzym贸w glikolitycznych), przy zachowaniu wysokiej wydajnosci kwasu
cytrynowego.
W pracach ze szczepami przemyslowymi niezwykle waznym, a zarazem trudnym etapem, jest
zastosowanie wlasciwej metody przechowywania zapewniajacej stabilnosc cech materialu
biologicznego. Do przyjetych w praktyce metod nalezy liofilizacja, przechowywanie konidi贸w w
mieszaninie z jalowym piaskiem, weglem aktywnym lub cytrynianem wapnia. Istotna sprawa jest
r贸wniez otrzymanie odpowiedniej ilosci i jakosci biochemicznej materialu szczepiennego, jakim sa
konidia szczepu przemyslowego. Stosowane pozywki sporulacyjne (pobudzajace wytwarzanie
konidi贸w) powinny indukowac w konidiach enzymy odpowiedzialne za synteze kwasu
cytrynowego. Najczesciej stosowane sa pozywki, kt贸re w swoim skladzie zawieraja niski poziom
wegla i azotu, natomiast wzbogacone sa w posredniki cyklu Krebsa. Praktyka wykazala, ze szczepy
przeznaczone do procesu wglebnego z uzyciem podloza mineralnego, aktywowane na podlozu
sporulacyjnym (ziemniaczano-glukozowo-agarowym o pH 6,0-7,0) zapewniaja wysoka wydajnosc
kwasu cytrynowego. Szczepy wykorzystywane w procesie powierzchniowym, w kt贸rym surowcem
jest melasa buraczana, wymagaja podloza sporulacyjnego zestalonego agarem, w kt贸rym obok
brzeczki slodowej w niewielkich ilosciach dodana jest melasa buraczana. Szczepy Aspergillus niger
stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego, na skutek pewnych zmian srodowiska
hodowlanego oraz sposobu przechowywania, moga sw贸j dotychczasowy metabolizm,
ukierunkowany na synteze kwasu cytrynowego, zmienic na oksydacyjny, wynikiem czego jest
gl贸wnie produkcja biomasy. To czesto wystepujace zjawisko stwarza koniecznosc ciaglej selekcji
odmian o pozadanych cechach. Najczesciej przyjeta metoda skriningowa jest ocena wlasciwosci
kwaszacych poszczeg贸lnych osobnik贸w danej populacji i izolowanie najbardziej aktywnych. Testy
te przeprowadza sie na pozywkach stalych z dodatkiem wskaznika wartosci pH. Dalsza selekcja
szczep贸w odbywa sie na podstawie laboratoryjnych test贸w biologicznych w pozywkach
stosowanych w produkcji kwasu cytrynowego.
Biochemiczne uwarunkowania nadprodukcji kwasu cytrynowego u Aspergillus
niger
Nadprodukcja kwasu cytrynowego u niekt贸rych odmian Aspergillus niger jest wynikiem zakl贸cen
w cyklu Krebsa wywolanych brakiem lub niska aktywnoscia enzym贸w odpowiedzialnych za jego
dalsza konwersje. Ten defekt biochemiczny jest uwarunkowany genotypowo, wiadomo jednak, ze
poprzez odpowiednie warunki hodowli aktywnosc szczep贸w w procesie biosyntezy moze byc
zintensyfikowana, zapewniajac wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego.
Korzystnymi warunkami procesu sa: wysokie stezenie cukru (ok. 10% w hodowli wglebnej i 16%
w hodowli powierzchniowej), niedob贸r jon贸w metali: Mn+2, Zn+2, Fe+2 (<0,1 mg/100 cm3),
ograniczona ilosc zwiazk贸w azotu i fosforu (limitacja wzrostu grzybni), niska wartosc pH, ok. 2,4-
2,6, dobre natlenienie srodowiska. Dwa ostatnie warunki odnosza sie gl贸wnie do procesu
wglebnego w pozywkach syntetycznych.
Kwas cytrynowy powstaje w poczatkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku kondensacji
acetylo-CoA i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntaze cytrynianowa (rys. 1). W procesie
rozwoju grzybni (trofofaza), a nastepnie produkcji kwasu cytrynowego (idiofaza) heksozy
asymilowane sa w dw贸ch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i pentozofosforanowym
(HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia sie w fazie intensywnego rozwoju grzybni, po czym ustepuje
glikolizie w fazie produkcji kwasu cytrynowego. Zatem gl贸wnym regulatorem szybkosci glikolizy
jest fosfofruktokinaza, kt贸ra staje sie jednoczesnie regulatorem biosyntezy kwasu cytrynowego.
Enzym ten jest wrazliwy na obecnosc cytrynianu w srodowisku, ale u szczep贸w Aspergillus niger w
procesie produkcji kwasu cytrynowego represja ta jest znoszona nadmiarem jon贸w NH4+ w
kom贸rkach, w wyniku zakl贸conych przemian bialkowych spowodowanych niedoborem w podlozu
jon贸w Mn2+. Mechanizmem regulujacym biosynteze kwasu cytrynowego jest takze ograniczenie
syntezy ATP, kt贸ry jest inhibitorem fosfofruktokinazy. Dowodzi to istnienia w grzybni
alternatywnej tlenowej drogi oddechowej, jalowej energetycznie, a wiec nie blokujacej glikolizy.
Ten typ oddychania tlenowego, czesto wystepujacy u roslin, nie zostal jeszcze dokladnie zbadany u
szczep贸w Aspergillus niger. Wykazano natomiast jego istnienie w grzybni Neurospora crasa oraz u
drozdzy z rodzaj贸w Candida i Rhodotorula, najczesciej podczas przejscia z fazy logarytmicznego
wzrostu do fazy stacjonarnej. Alternatywna droga oddechowa ujawnia sie w momencie oslabienia
oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej, wtedy indukowana jest synteza oksydazy
alternatywnej, ukladu enzymatycznego katalizujacego przenoszenie elektron贸w na tlen. Indukcje tej
oksydazy w kom贸rkach grzybni moze wywolac:
- nagromadzenie sie NADH,
- zmniejszenie zapotrzebowania na ATP,
- niedob贸r ADP w mitochondriach,
- niedob贸r jon贸w Cu+2 niezbednych do funkcjonowania oksydazy cytochromowej.
Wymienione czynniki sprawiaja, ze cytoplazmatyczny koenzym NADH powstajacy w procesie
glikolizy jest utleniany z udzialem oksydazy alternatywnej szlakiem, w kt贸rym energia nie
wydziela sie w postaci ATP, lecz energii cieplnej. Mechanizm ten uruchamia sie przy rozkojarzeniu
fosforylacji oksydatywnej. Oksydaza alternatywnego oddychania cechuje sie, w odr贸znieniu od
oksydazy cytochromowej, niskim powinowactwem do tlenu. Oznacza to, ze dzialalnosc tego
enzymu wymaga znacznie wyzszego stezenia tlenu w srodowisku niz droga cytochromowa.
Badania wykazaly, ze dopiero stezenie tlenu powyzej 21% powoduje wzrost aktywnosci
oddychania alternatywnego. We wglebnym procesie otrzymywania kwasu cytrynowego, w fazie
produkcji przy intensywnym napowietrzaniu, moze byc wiec wzbudzana ta droga oddechowa.
Zakl贸cenie procesu wynikajace z braku doplywu tlenu moze spowodowac utrate tej aktywnosci i
przywr贸cenie oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej. Efektem tych zmian jest
zahamowanie syntezy kwasu cytrynowego na korzysc produkcji biomasy. Takie zjawisko
obserwuje sie podczas awarii systemu natleniania w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego
metoda wglebna.
Rys. 1. Szlaki metaboliczne przemiany glukozy do kwasu cytrynowego u Aspergillus niger: l - syntaza
cytrynianowa, 2,3- hydrataza akonitanowa, 4 - dehydrogenaza izocytrynianowa, 5 - dehydrogenaza 2-
ketoglutaranowa, 6 - liaza izocytrynianowa; pogrubione linie oznaczaja miejsca oslabionej aktywnosci
enzymatycznej
Do poznanych innych mechanizm贸w regulujacych synteze kwasu cytrynowego nalezy oslabienie
przemian enzymatycznych w cyklu Krebsa na etapach:
- hydratazy akonitanowej (hamowanej deficytem jon贸w Mn2+ i Fe2+),
- mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej (hamowanej cytrynianem),
- dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (hamowanej wysokim stezeniem cukru i jonami NH4+).
Biosynteza kwasu cytrynowego u Aspergillus niger zwiazana jest takze z cyklem kwas贸w
dikarboksylowych - glioksalowym (rys. 1). Cykl ten przez reakcje anaplerotyczne (uzupelniajace)
dostarcza kwasu szczawiowego, kt贸ry jest prekursorem kwasu cytrynowego.
Produkcja kwasu cytrynowego metoda powierzchniowa
Powszechne uzywanie okreslenia metoda powierzchniowa i metoda wglebna otrzymywania kwasu
cytrynowego wynika z odmiennych warunk贸w hodowli, powodujacych r贸zna morfologie grzybni.
W metodzie powierzchniowej w warunkach statycznych grzybnia Aspergillus niger rozwija sie na
powierzchni pozywki, tworzac zwarta pleche zlozona z mocno rozgalezionych strzepek. W
metodzie wglebnej grzybnia rosnie w calej objetosci pozywki, tworzac w wyniku ciaglego jej ruchu
dosc zwarte fragmenty w formie grudek (pellets). Wsp贸lna cecha obydwu metod otrzymywania
kwasu cytrynowego jest ich dwufazowosc. W pierwszej zachodzi intensywny rozw贸j grzybni, trwa
ona przewaznie do 72 godziny hodowli, po czym nastepuje druga faza, w kt贸rej intensywnie
wytwarzany jest kwas cytrynowy przy ograniczonym wzroscie grzybni. W hodowli
powierzchniowej obydwie fazy przebiegaja w systemie jednostopniowym. W procesie wglebnym
pierwsza faza odbywa sie w podlozu inokulacyjnym, o skladzie r贸zniacym sie od fermentacyjnego,
gl贸wnie ze wzgledu na zmniejszona ilosc zr贸dla wegla. Wegetatywny rozw贸j grzybni w obydwu
metodach rozpoczyna sie uaktywnianiem i kielkowaniem konidi贸w, wytwarzaniem kielka, a
nastepnie strzepki rostowej, kt贸ra wydluzajac sie i rozgaleziajac, tworzy grzybnie o morfologii
odpowiadajacej warunkom hodowli. W metodzie powierzchniowego procesu otrzymywania kwasu
cytrynowego najczesciej stosowanym surowcem jest melasa buraczana. Melasa buraczana
zakwalifikowana jako surowiec jest rozcienczona do zawartosci sacharozy ok. 16%, a nastepnie
uzupelniona solami mineralnymi (KH2PO4 0,008%, ZnSO4 x 7H20 0,0008% oraz K4Fe(CN)6 -
ok. 0,08%); pH pozywki jest regulowane do wartosci 6,4-6,8. Dokladna ilosc K4Fe(CN)6 musi byc
eksperymentalnie okreslona dla kazdej odmiany melasy buraczanej, poniewaz zelazocyjanek potasu
wytraca ze srodowiska metale ciezkie - Fe, Zn, Pb, kt贸rych pewne ilosci sa niezbedne dla procesu
biosyntezy kwasu cytrynowego. Sterylna pozywke melasowa w objetosci 500-600 dm3 rozlewa sie
za pomoca odpowiednich urzadzen do tac, o wymiarach 2 m dlugosci, 2,5 m szerokosci i 0,16 m
glebokosci. Tace sa sporzadzone ze stali kwasoodpornej i sa zamontowane na specjalnych
stelazach, umieszczanych w komorach z regulacja temperatury i napowietrzania. Kiedy temperatura
pozywki obnizy sie do wartosci 40癈, szczepi sie ja konidiami plesni zmieszanymi z weglem
aktywnym jako nosnikiem. Po 24 godzinnej inkubacji pojawia sie widoczna cienka grzybnia, kt贸rej
intensywny wzrost trwa do 48-72 godzin, po czym slabnie na korzysc produkcji kwasu
cytrynowego. Dojrzala grzybnia osiaga grubosc 2-3 cm, jej warstwa dolna stykajaca sie z podlozem
jest odpowiedzialna za synteze kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu wynosi 168-216 godz. w
temp. 30癈, zapewniajac wydajnosc kwasu cytrynowego na poziomie 70-80% w stosunku do
poczatkowej ilosci cukru w pozywce. W tym procesie obok kwasu cytrynowego, stanowiacego
okolo 80% zawartosci wszystkich kwas贸w, do podloza wydzielany jest kwas szczawiowy i kwas
glukonowy oraz w sladowych ilosciach kwasy z cyklu Krebsa.
Zanieczyszczenia mikrobiologiczne
Zr贸dlem zanieczyszczen mikrobiologicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu
cytrynowego jest przede wszystkim melasa buraczana. W surowcu tym wystepuja gl贸wnie bakterie
z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, a takze Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Zr贸dlem tych
ostatnich bakterii opr贸cz melasy moze byc takze woda stosowana w procesie technologicznym, jesli
nie spelnia wymagan okreslonych norma. Wszystkie drobnoustroje wystepujace jako
zanieczyszczenia sa zdolne do redukcji azotan贸w (V) do azotan贸w (III), kt贸re dzialaja hamujaco na
rozw贸j grzybni. Badania wykazaly, ze w podlozu melasowym, po niewlasciwie przeprowadzonej
sterylizacji, moga pozostac zywe bakterie z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, wywierajace
antagonistyczny wplyw na rozw贸j grzybni Aspergillus niger. Sposr贸d plesni najczestszym
zanieczyszczeniem jest Penicillium purpurogenum i Penicillium rubrum. W procesie
technologicznym konidia tych plesni dostaja sie z powietrzem stosowanym do przewietrzania
kom贸r, a takze wraz ze szczepionka konidi贸w Aspergillus niger podczas jej rozpylania na
powierzchnie pozywki. Plesnie te sa bogate w enzymy hydrolityczne, dzieki kt贸rym rozwijaja sie
na grzybni Aspergillus niger, powodujac jej lize. Aby uniknac skutk贸w zanieczyszczen
mikrobiologicznych, nalezy stosowac aktywna szczepionke grzybni Asperillus niger, szybko
opanowujaca srodowisko i obnizajaca wartosc pH do poziomu hamujacego rozw贸j mikroflory
bakteryjnej. Podobnie jak w kazdym procesie biotechnologicznym musi byc zapewniona wysoka
czystosc aparatury i kom贸r fermentacyjnych oraz powietrza do ich przewietrzania, poniewaz w
przeciwnym razie te srodowiska stac sie moga zr贸dlem zanieczyszczenia r贸zna mikroflora,
zakl贸cajaca proces produkcji kwasu cytrynowego.
Wydzielanie kwasu cytrynowego z podloza hodowlanego
Wydzielanie kwasu cytrynowego odbywa sie tzw. metoda cytrynianowa. Polega ona na wytracaniu
na goraco cytrynianu wapnia, traktujac roztw贸r pofermentacyjny wodorotlenkiem wapnia.
Wytworzony osad cytrynianu wapnia [Ca3(C6H5O7)2] po oddzieleniu od masy reakcyjnej zadaje sie
roztworem H2SO4, w celu otrzymania kwasu cytrynowego w postaci wolnej. Wytracony gips
oddziela sie przez filtracje, roztw贸r zas zageszcza i wydziela czysty produkt przez krystalizacje.
Handlowy kwas cytrynowy wyodrebniony ta metoda jest zwiazany z jedna czasteczka wody
(C6H5O7xH2O). Metoda cytrynianowa jest bardzo uciazliwa dla przemyslowej produkcji kwasu
cytrynowego, z uwagi na duze zuzycie kwasu siarkowego, wodorotlenku wapnia, a takze
wytwarzanie w tym procesie nadmiernych ilosci gipsu. W Instytucie Technologii Przemyslu
Chemicznego i Spozywczego Akademii Ekonomicznej we Wroclawiu zostala opracowana metoda
wydzielania i oczyszczania kwasu cytrynowego tzw. metoda bezcytrynianowa. Moze byc ona
wykorzystana tylko w tych przypadkach, w kt贸rych do biosyntezy kwasu cytrynowego stosowane
sa substraty o wysokiej czystosci, tj.: glukoza, skrobia, maczki cukrowe, a wiec gl贸wnie we
wglebnej hodowli Aspergillus niger. Metoda bezcytrynianowa polega na:
- dezaktywacji grzybni w temp. 70癈 i oddzieleniu od roztworu hodowlanego,
- oczyszczeniu filtratu garbnikami i ziemia okrzemkowa,
- odbarwieniu na kolumnie weglowej,
- zatezeniu w wyparce pr贸zniowej do 72% zawartosci kwasu cytrynowego,
- krystalizacji kwasu cytrynowego w temp. 7癈.
Wydajnosc krystalizacji kwasu cytrynowego wynosi okolo 50%. Odciek miedzykrystaliczny po
odbarwieniu weglem aktywnym oczyszcza sie na jonitach (kationit i anionit). Proces oczyszczania
jest tak prowadzony, aby oczyszczony odciek odpowiadal wymaganiom stawianym przez norme na
spozywczy kwas cytrynowy w plynie.
Powierzchniowa biosynteza kwasu cytrynowego z wykorzystaniem melasy jako surowca dostarcza
duzych ilosci sciek贸w o wysokim wskazniku BZT5 Filtrat, po oddzieleniu cytrynianu wapnia,
mozna po zageszczeniu stosowac jako dodatek do pasz lub poddawac beztlenowej fermentacji
metanowej w oczyszczalniach sciek贸w. Istnieje takze koncepcja wykorzystania filtratu do produkcji
drozdzy paszowych. Powaznym problemem ekologicznym jest gips wytwarzany w procesie
oczyszczania kwasu cytrynowego. Zagospodarowanie gipsu jako materialu budowlanego jest
mozliwe dopiero po odpowiednim oczyszczeniu. Roztw贸r hodowlany po oddzieleniu grzybni
zawiera obok gl贸wnego metabolitu, jakim jest kwas cytrynowy, wiele cennych enzym贸w, gl贸wnie
enzymy pektynolityczne, proteolityczne, a takze glukanazy, co stwarza mozliwosc ich
przemyslowego pozyskiwania. Ponadto zr贸dlem wielu enzym贸w (proteinazy, amylazy, pektynazy,
oksydaza glukozowa), kt贸re moga byc wydzielane dla cel贸w handlowych, jest grzybnia Aspergillus
niger. Wytwarzana w duzych ilosciach w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego moze byc takze
wykorzystana na cele paszowe, poniewaz zawiera ponad 40% bialka w suchej masie, z czego
polowa to bialko dobrze przyswajalne. Ponadto zawiera liczne mikroelementy. Dodatek suszu
grzybowego w ilosci 10-15% do pasz dla zwierzat hodowlanych, dor贸wnuje wartosci odzywczej
preparatom drozdzy paszowych.
Melasa buraczana jako surowiec do produkcji kwasu cytrynowego
Melasa buraczana jest ubocznym produktem przemyslu cukrowniczego. Jej sklad chemiczny
podano na rys. 4.
Rys. 4. Sklad chemiczny melasy buraczanej
W grupie niecukr贸w melasy (zwiazk贸w rozpuszczalnych, nie bedacych sacharoza), stanowiacych
okolo 30% zawartosci suchej masy, znajduja sie zwiazki, kt贸re sprzyjaja rozwojowi
drobnoustroj贸w, w tym takze szczep贸w produkcyjnych oraz takie, kt贸rych dzialanie jest dla
mikroorganizm贸w szkodliwe. Do pierwszej grupy naleza aminokwasy, biotyna, kwas pantotenowy,
mezoinozytol. W drugiej grupie znajduja sie zwiazki o charakterze nieorganicznym (aniony,
kationy) oraz zwiazki organiczne, tj. kwasy organiczne, zwiazki bialkowe, zwiazki barwne oraz
inne, o r贸znej strukturze chemicznej. Suma wszystkich zwiazk贸w melasy wykorzystywanych przez
drobnoustroje stanowi 51-58% suchej masy. Szkodliwe dla drobnoustroj贸w przemyslowych
zwiazki melasy maja r贸zne pochodzenie. Niekt贸re z nich powstaja podczas gnicia burak贸w w
czasie ich przechowywania w kopcach badz pochodza ze srodk贸w chemicznych, kt贸re stosuje sie
dla zahamowania szerzenia sie kopcowej zgnilizny". Inne zr贸dlo zwiazk贸w szkodliwych, to
preparaty uzywane w zabiegach agrotechnicznych (nawozy mineralne, preparaty chwasto- i
owadob贸jcze). Nie bez znaczenia dla jakosci surowcowej melasy sa zwiazki powstale podczas
przerobu burak贸w, tj. kwasy lotne, azotany (V), zwiazki barwne, kt贸re tworza sie juz w
ekstraktorze i w dalszych etapach oczyszczania soku. Niezwykle wazna role w tworzeniu
niekorzystnej frakcji melasy spelniaja pomocnicze srodki chemiczne stosowane w procesie
otrzymywania cukru. Do powszechnie uzywanych preparat贸w w przemysle cukrowniczym naleza:
flokulanty, emulgatory, dezynfektanty oraz srodki do gaszenia piany. W polskim cukrownictwie
jako preparaty przeciwpianowe stosuje sie l贸j barani, Spumole BJ, K-3, Rokamix oraz inne,
pochodzenia zagranicznego. Przecietnie na 100 ton burak贸w zuzycie srodka do gaszenia piany
wynosi od 0,6 do 24 kg. Ten bardzo szeroki przedzial uzytej ilosci preparat贸w przeciwpianowych
zalezy przede wszystkim od jakosci przerabianego surowca. Buraki niedojrzale, zbyt dlugo
skladowane, zmarzniete powoduja, ze wychodzacy z ekstraktora sok bardzo sie pieni, co zmusza
technolog贸w do wiekszego zuzycia srodka przeciwpianowego Kumulowanie sie w melasie tego
rodzaju preparat贸w o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych nie wplywa korzystnie na jej
wartosc surowcowa. W procesie powierzchniowej fermentacji cytrynowej, w kt贸rej melasa jest
podstawowym surowcem, nadmiar preparat贸w przeciwpianowych, np. typu Spumol K-3, zakl贸ca
proces rozwoju grzybni juz w stadium kielkowania konidi贸w, a utworzona grzybnia jest
nieprawidlowa i latwo ulega zatopieniu.
W grupie szczep贸w Aspergillus niger, cechujacych sie wysoka aktywnoscia biosyntezy kwasu
cytrynowego, istnieja odmiany wykazujace zr贸znicowana wrazliwosc na obecne w melasie zwiazki
zakl贸cajace rozw贸j grzybni i produkcje kwasu cytrynowego, z tego tez wzgledu przy selekcji
szczep贸w przemyslowych uwzgledniana jest ich tolerancja na zmienny sklad melasy i zawarte w
niej inhibitory wzrostu. Jednakze dob贸r materialu biologicznego i jego selekcja pod tym wzgledem
jest utrudniona ze wzgledu na zlozonosc skladu chemicznego melasy i obecnosc r贸znych
zwiazk贸w, kt贸re moga byc odpowiedzialne za wadliwosc tego surowca. Klasyfikacja melas do
fermentacji cytrynowej oparta jest na danych z analizy chemicznej objetych norma PN 76/R-64772
(Tab. 1). Jednakze zakres stosowanych analiz chemicznych nie obejmuje kontroli wszystkich
skladnik贸w melas buraczanych, a zwlaszcza tych, kt贸re maja szkodliwy wplyw na rozw贸j grzybni
Aspergillus niger. Z tego wzgledu niezbednym testem do oceny przydatnosci surowca melasowego
jest wynik laboratoryjnych pr贸b hodowli Aspergillus niger. Uzdatnianie melas do cel贸w produkcji
kwasu cytrynowego (a takze itakonowego) odbywa sie poprzez dodatek do podloza zelazocyjanku
potasu w celu usuniecia nadmiaru jon贸w metali ciezkich, gl贸wnie zelaza. Inna metoda zalecana dla
procesu wglebnego jest odsalanie melasy na wymieniaczach jonowych.
Tab. 1. Klasyfikacja melas buraczanych wg PN-76/R-64772
Melasy buraczane
Parametr
I klasa II klasa
癇x 75,0 75,0-73,0
pH 7,0-8,5 7,0-9,0
Zawartosc sacharozy [%] =47,0 =44,0
Czystosc (Cz.)* [%] 61,0-66,0 60,0-58,0
Cukier inwert. [%] <1,0 nie norm.
Azot og贸lny [%] <1,7 2,3
Kwasy lotne (CH3COOH) <1,4 nie norm.
Sole Ca i Mg (CaO) [%] <1,2 <2.0
SO2 [%] =0 -
Og贸lna liczba
105 106
drobnoustroj贸w
*Cz. - procentowa zawartosc sacharozy w suchej masie
Produkcja kwasu cytrynowego metoda wglebna
Wglebna metoda biosyntezy kwasu cytrynowego w skali przemyslowej prowadzona jest w
bioreaktorach o pojemnosci od 50 do 100 m3 z uzyciem surowc贸w o wyzszym stopniu czystosci niz
w metodzie powierzchniowej, tj. cukru handlowego (sacharoza), sok贸w cukrowniczych, maczek
cukrowych, hydrolizat贸w skrobiowych. Rzadziej do tego celu wykorzystywana jest melasa
buraczana, poniewaz proces wglebny z jej uzyciem nie zapewnia odpowiedniej wydajnosci kwasu
cytrynowego. W przypadku stosowania pozywki mineralnej, w kt贸rej zr贸dlem wegla jest handlowa
sacharoza, wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego wynosi ponad 80%. Obok zr贸dla wegla w
ilosci 100-150 g/dm3, pozywka zawiera w swoim skladzie niezbedne sole mineralne, tj. (NH4)2SO4
- 2g/dm3, MgSO4x7H2O 0,2g/dm3, KH2PO4 - 0,2 g/dm3, a pH regulowane jest do wartosci 2,5-
3,0. W zaleznosci od specyfiki szczepu Aspergillus niger pozywke w bioreaktorze szczepi sie
zawiesina konidi贸w w ilosci 105/cm3, po ich wczesniejszej 6-8 godzinnej inkubacji lub zawiesina
grzybni inokulacyjnej otrzymanej po 24-36 godzinach hodowli, stosujac 10% w stosunku do
objetosci pozywki w bioreaktorze. W metodzie hodowli wglebnej, w wyniku ciaglego mieszania,
grzybnia rozwija sie w calej objetosci podloza. Po 48 godzinach rozpoczyna sie faza produkcji
kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu biosyntezy, do momentu wyczerpania zr贸dla wegla,
wynosi od 120 do 168 godzin w temperaturze 30-32癈 i przy napowietrzaniu jalowym powietrzem
w ilosci 0,1-0,4 vvm (objetosc powietrza dostarczana do bioreaktora w stosunku do objetosci
podloza, wciagu minuty). Zaleta tej metody w por贸wnaniu z metoda powierzchniowa z uzyciem
melasy, jest kr贸tszy czas trwania procesu, mniejsze zagrozenie rozwojem obcej mikroflory z uwagi
na niska wartosc pH i zamkniete bioreaktory oraz mozliwosc wydzielania kwasu cytrynowego z
pozywki na drodze krystalizacji, a takze na mniejsze obciazenie sciekami. Otrzymywanie kwasu
cytrynowego metoda hodowli wglebnej stwarza jednak wiele trudnosci natury bioinzynieryjnej,
kt贸re wynikaja ze specyficznej morfologii grzybni w tych warunkach. Ciagly ruch cieczy
wywolany mieszaniem i napowietrzaniem powoduje, ze grzybnia w bioreaktorze wystepuje w
postaci klebk贸w (pellets) o srednicy 0,2-3,0 mm badz strzepek grzybni o r贸znym stopniu
rozgalezienia lub tez jako mieszanina obu form morfologicznych. Taki wzrost grzybni, a takze
gestosc zawiesiny wynoszaca do 50 kg s.m./m3 powoduja, ze srodowisko hodowlane osiaga wysoka
lepkosc. W tak niekorzystnych reologicznie warunkach utrudniona staje sie wymiana masy, a takze
dyfuzja tlenu do podloza oraz do kom贸rek grzybni. Znajomosc fizjologii i morfologii grzyb贸w
strzepkowych oraz parametr贸w reologicznych (lepkosc, gestosc) zmieniajacych sie wraz z
rozwojem grzybni jest niezbedna do wlasciwego zaprojektowania bioreaktora z odpowiednim
systemem doprowadzenia powietrza do srodowiska, mieszaniem masy reakcyjnej zapewniajacym
dobre warunki wymiany masy i wymiany gazowej (CO2, O2). Znane podstawowe zasady wymiany
masy i ciepla w biorektorach, dotyczace plyn贸w newtonowskich, w przypadku hodowli grzyb贸w
strzepkowych sa nieprzydatne, poniewaz organizmy te tworza zawiesiny o wlasciwosciach
nienewtonowskich. Stad tez bioreaktory stosowane do biosyntezy kwasu cytrynowego musza byc
specjalnie konstruowane. Najczesciej stosuje sie bioreaktory z mieszadlem turbinowo-tarczowym,
kt贸rego ruch powoduje silna dyspersje powietrza w cieczy. Najbardziej efektywna wymiane masy i
dyfuzje powietrza zapewniaja bioreaktory bezmieszadlowe z naturalna cyrkulacja cieczy typu air-
lift, w kt贸rych powietrze do wnetrza aparatu wprowadzane jest przez odpowiednie urzadzenia
napowietrzajace. Bioreaktory wykonane sa ze stali kwasoodpornej i sa wyposazone w
oprzyrzadowanie pomiarowe, tj. elektrode tlenowa, elektrode redox (do pomiaru potencjalu
oksydoredukcyjnego), termometr polaczony z regulatorem temperatury, rotametr, pehametr,
regulator obrot贸w walu mieszadla i odpieniacz mechaniczny. W procesach prowadzonych w
bioreaktorach zjawisko pienienia sie nie zawsze skutecznie moze byc likwidowane mechanicznie,
czesto istnieje koniecznosc stosowania srodk贸w przeciwpianowych, ale w spos贸b kontrolowany,
poniewaz nadmiar tego rodzaju preparat贸w o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych zakl贸ca
rozw贸j grzybni i zmniejsza wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
kwas cytrynowyKwas cytrynowyKWAS PALMITYNOWYcytryniec chinskiKuchnia francuska po prostu (odc 25) Tarta cytrynowaKruche ciastka cytrynowo migda艂owekwas solny HCl艁atwa kuchnia indyjska (odc 005) Cytrynowy ry偶(odc 12) grilowane pieczarki z natk膮 pietruszki i cytryn膮Aksamitna tarta cytrynowa z bit膮 艣mitan膮KWAS?ENOZYNOTRIFOSFOROWYKurczak w sosie cytrynowymCYKL KWASU CYTRYNOWEGOdrink cytrynowyBioch呕yw(Biotech)膯w4 Kwas askorbinowywi臋cej podobnych podstron