AMINOKWASY I BIAAKA
Aminokwasy są związkami organicznymi, które posiadają w cząsteczce grupę karboksylową i
grupę aminową.
W zale\ności od miejsca poło\enia grupy aminowej, wyró\nia się ą, , ł (itd.) aminokwasy.
Aminokwasy mo\na podzielić tak\e w zale\ności od budowy łańcucha bocznego. Wyró\nia
się:
a) aminokwasy, których łańcuch boczny stanowi wodór lub grupa alkilowa:
glicyna (Gly, G), alanina (Ala, A), walina (Val, V), leucyna (Leu, L), izoleucyna (Ile, I);
b) aminokwasy zawierające w łańcuchu bocznym grupę hydroskylową:
seryna (Ser, S), treonina (Thr, T);
c) aminokwasy zawierające w łańcuchu bocznym siarkę:
cysteina (Cys, C), metionina (Met, M);
d) aminokwas, w którym grupa aminowa jest częścią pierścienia i jest drugorzędowa:
prolina (Pro, P);
e) aminokwasy zawierające w pierścieniu ugrupowanie aromatyczne:
fenyloalanina (Phe, F), tyrozyna (Tyr, T), tryptofan (Trp, W);
f) aminokwasy kwaśne, zawierające jedną grupę aminową i dwie karboksylowe:
kwas asparaginowy (Asp, D), asparagina (Asn, N), kwas glutaminowy (Glu, E), glutamina
(Gln, Q);
g) aminokwasy zasadowe, zawierające jedną grupę karboksylową i grupy zasadowe:
lizyna (Lys, K), arginina (Arg, R), histydyna (His, H).
Charakterystycznymi cechami aminokwasów są: bardzo wysokie temperatury topnienia,
bardzo dobra rozpuszczalność w wodzie i brak rozpuszczalności w niepolarnych
rozpuszczalnikach organicznych. Jest to spowodowane szczególnymi właściwościami
chemicznymi wynikającymi z faktu, i\ aminokwasy są związkami amfoterycznymi, co
oznacza, \e mogą reagować zarówno z kwasami jak i zasadami (a zarazem posiadają w swojej
strukturze zarówno ugrupowanie kwasowe jak i zasadowe). Najbardziej stabilną formą
aminokwasu jest sól wewnętrzna (tzw. jon obojnaczy). Natomiast w roztworze, w zale\ności
od pHzmienia się forma, w jakiej występują. pH, w którym wypadkowy ładunek aminokwasu
jest równy zero nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pI). W pI rozpuszczalność
aminokwasów w wodzie jest najmniejsza.
1
Dzięki tym właściwościom mo\liwe jest wykorzystanie szeregu metod analitycznych w
analizie aminokwasów, nale\ą do nich np. elektroforeza, elektroforeza kapilarna,
chromatografia jonowymienna.
W określonych warunkach pomiędzy grupą aminową jednego aminokwasu i grupą
karboksylową innego aminokwasu mo\e powstać wiązanie peptydowe. Aminokwasy tworzą
w taki sposób łańcuchy, które w zale\ności od długości (od ilości budujących aminokwasów)
nazywa się peptydami, polipeptydami (łańcuchy krótsze) lub białkami (łańcuchy dłu\sze).
wiązanie peptydowe
dwa ą-aminokwasy dipeptyd
Ponad 700 ró\nych aminokwasów wstępuje naturalnie w przyrodzie, jednak tylko 20 z nich
buduje białka charakterystyczne dla \ywych organizmów. Wszystkie aminokwasy tworzące
białka nale\ą do szeregu ą oraz posiadają konfigurację L (wyjątek stanowi glicyna, która nie
posiada centrum asymetrycznego). Ka\dy z nich oprócz nazwy zwyczajowej posiada
trzyliterowy skrót, który stosuje się podczas pisania struktury peptydów, a tak\e skrót
jednoliterowy stosowany podczas zapisywania sekwencji aminokwasów w białkach.
Identyfikacja aminokwasów mo\liwa jest zarówno dzięki charakterystycznym reakcjom grup
aminowej i karboksylowej, występujących we wszystkich aminokwasach, ale równie\
reakcjom specyficznym dla poszczególnych grup funkcyjnych występujących w łańcuchu
bocznym.
2
ĆWICZENIA LABORATOTYJNE
W otrzymanych probówkach znajdują się próbki badanych związków.Na podstawie
wykonanych prób analitycznych nale\y stwierdzić, w której probówce znajduje się
odpowiednia substancja.
Rodzaj Reakcje charakterystyczne Wynik próby
substancji
Stapianie z sodem i próba Lassaigne a Potwierdzenie obecności azotu
Reakcja ninhydrynowa
ą-Aminokwas
Reakcja z solami miedzi Reakcja pozytywna
Reakcja deaminacji i dekarboksylacji
Aminokwas z Stapianie z sodem i próba Lassaigne a Potwierdzenie obecności azotu
ugrupowaniem
Reakcja ksantoproteinowa Reakcja pozytywna
aromatycznym
Aminokwas Stapianie z sodem i wykrywanie siarki Potwierdzenie obecności siarki
zawierający Reakcja pozytywna, jeśli
siarkę(grupa występuje grupa SH, negatywna,
Wykrywanie grup tiolowych
-SH lub -CH2- gdy siarka występuje w postaci
S-CH3) -CH2-S-CH3
Reakcja ninhydrynowa Reakcja pozytywna
Reakcja pozytywna jeśli w skład
Reakcja ksantoproteinowa białka wchodzą aminokwasy
aromatyczne
Białko
Reakcja biuretowa
Reakcje strąceniowe Reakcja pozytywna
Denaturacja
REAKCJA NINHYDRYNOWA
Aminokwasy oraz białka dają barwną reakcję z etanolowym roztworem ninhydryny. Reakcja
ta nie jest specyficzna wyłącznie dla aminokwasów. Amoniak oraz część związków
zawierających I-rzędową grupę aminową dają z ninhydryną charakterystyczne zabarwienie.
Aminokwasy, peptydy i białka powodują, i\ powstaje zabarwienie niebieskie, fioletowe,
czerwono-fioletowe lub czerwone.
Wykonanie oznaczenia:
Ok. 50 mg aminokwasu nale\y rozpuścić w ok. 0,5 ml 0,2% etanolowego roztworu
ninhydryny. Zabarwienie powstaje natychmiast lub dopiero w następstwie ogrzania
mieszaniny do wrzenia.
3
REAKCJA DEAMINACJI I DEKARBOKSYLACJI
ą-Aminokwasy ulegają deaminacji i dekarboksylacji pod wpływem czynników utleniających
(podbromianu lub podchlorynu sodu). Końcowymi produktami reakcji są: amoniak oraz
aldehyd ubo\szy o jeden atom węgla ni\ wyjściowy aminokwas. Aldehyd powstaje przez
dekarboksylację tworzącego się pośrednio ą-ketokwasu.
O O
H2N O
+ NaClO C C NH3 + NaCl
+
CH C
R OH
R OH
O
CO2
+
R C
H
Utworzony aldehyd mo\na wykryć np. w reakcji z odczynnikiem Schiffa.
Wykonanie oznaczenia:
Około 50 mg substancji miesza się z ok. 0,5 ml nasyconego roztworu podchlorynu sodu,
probówkę mo\na łagodnie ogrzać. Następnie dodaje się kilka kropli odczynnika Schiffa
(roztwór fuksyny w kwasie siarkowym (IV)). O obecności aminokwasu świadczy ró\owa lub
czerwona barwa.
REAKCJA Z SOLAMI MIEDZI
Alifatyczne ą-aminokwasy oraz aminokwasy aromatyczne z grupą NH2 w bocznym
łańcuchu dają barwne kompleksy z jonami metali, np. w reakcji z siarczanem miedzi (II)
tworzą kompleksy o zabarwieniu ciemnoniebieskim:
CO
O
R-CH-NH2
Cu
CO-O H2N-CH-R
Wykonanie oznaczenia:
Do wodnego roztworu aminokwasu nale\y dodać kroplami roztwór CuSO4. Probówkę mo\na
łagodnie ogrzać. Roztwór przyjmuje ciemnoniebieskie zabarwienie. Aby właściwie
zinterpretować wynik nale\y równolegle wykonać ślepą próbę.
WYKRYWANIE SIARKI
Stwierdzenie obecności jonów siarczkowych (S2-) w przesączu uzyskanym po stopieniu
związku z sodem, jest pośrednim dowodem na obecność siarki w badanym związku. Poni\ej
podano dwie metody identyfikacji jonów siarczkowych (reakcja z
pentacyjanonitrozylo\elazianem (III) sodu, reakcja z HCl).
4
1. Reakcja z pentacyjanonitrozylo\elazianem (III) sodu (tzw. nitroprusydkiem sodu)
Wykonanie oznaczenia:
Do probówki zawierającej ok. 1 ml przesączu otrzymanego po stopieniu analizowanej
substancji z sodem dodaje się 2-3 krople świe\o sporządzonego 1% roztworu nitroprusydku
sodu. W przypadku obecności jonów S2- powstaje rozpuszczalne w wodzie połączenie
kompleksowe o intensywnie fioletowo-czerwonym zabarwieniu.
Na2S + Na2[Fe(CN)5NO] Na4[Fe(CN)5NOS]
Próba ta jest bardzo czuła i pozwala wykryć śladowe ilości jonów siarczkowych.
2. Reakcja z HCl
Wykonanie oznaczenia:
Do probówki zawierającej ok. 1 ml przesączu otrzymanego po stopieniu analizowanej
substancji z sodem dodaje się kroplami 10% HCl do uzyskania pH w granicach 1-3 (wobec
papierka wskaznikowego). Przy du\ym stę\eniu jonów S2-wyczuwalny jest nieprzyjemny
zapach siarkowodoru.
Na2S + 2HCl 2NaCl + H2Sę!
WYKRYWANIE GRUP TIOLOWYCH
Grupy tiolowe SH tworzą z pentacyjanonitrozylo\elazianem (III) sodu (nitroprusydkiem
sodu)w środowisku zasadowym związek kompleksowy o zabarwieniu czerwono-fioletowym,
według przedstawionej reakcji:
[Fe3(CN)5NO]2- + NH3 + R-SH [Fe2(CN)5NOS-R]3- + NH4+
Wykonanie oznaczenia:
Do wodnego roztworu badanej substancjidodaje się 5 kropli 10% amoniaku, po czym wkrapla
się świe\o sporządzony 1-2% roztwór nitroprusydku sodu powstaje zabarwienie czerwone
lub czerwono-fioletowe.
REAKCJA KSNATOROTEINOWA
Aminokwasy aromatyczne jak i białka zwierające w swoim składzie aminokwasy
aromatyczne reagują ze stę\onym kwasem azotowym (V) tworząc nitrowe pochodne tych
aminokwasów o charakterystycznym \ółtym zabarwieniu. W środowisku zasadowym
pochodne odszczepiają barwne aniony nitrofenolanowe.
5
Wykonanie oznaczenia:
Do ok. 0,5 ml roztworu aminokwasu aromatycznego lub rozcieńczonego roztworu białka
dodaje się 0,5 ml stę\onego HNO3. Powstaje \ółte zabarwienie. W wypadku braku
zabarwienia próbkę mo\na ostro\nie ogrzać. Po ostudzeniu próbkę alkalizuje się 5%
roztworem NaOH. Powstaje zabarwienie pomarańczowe.
UWAGA!!! Stę\ony HNO3 jest odczynnikiem \rącym, wszystkie reakcje, które wymagają
jego u\ycia nale\y wykonywać pod digestorium.
REAKCJA BIURETOWA
Obecność wiązania peptydowego (-CO-NH-) charakterystycznego dla białek wykrywa się
za pomocą tzw. reakcji biuretowej. Daje ją równie\ mocznik (po ogrzaniu) oraz związki,
które posiadają dwa wiązania amidowe w cząsteczce jak diamid kwasu szczawiowego i
malonowego.Z siarczanem miedzi (II) w roztworze zasadowym substancje te dają barwne
związki kompleksowe.
Tworzenie biuretu z mocznika:
ogrzewanie
2NH2-CO-NH2 NH2-CO-NH-CO-NH2 + NH3ę!
Wykonanie oznaczenia:
Do roztworu lub zawiesiny białka w wodzie dodaje się 1 ml 10% roztworu NaOH i 1-2 krople
roztworu CuSO4. Roztwór barwi się na kolor fioletowy (lub czerwono-fioletowy).
REAKCJE STRCENIOWE
Charakterystyczną właściwością białek jest mo\liwość wytrącania ich z roztworów za
pomocą kationów lub anionów. Gdy wytrącanie białka z roztworu zachodzi pod wpływem
roztworów soli, mówimy wtedy o tzw. wysalaniu. Po dodaniu do roztworu białka nasyconego
roztworu soli jak np. (NH4)2SO4, MgSO4, Al2(SO4)3, zachodzi zobojętnianie ładunków
elektrycznych cząsteczek białka przez jony o przeciwnym znaku. Obserwuje się powstanie
osadu. Białko mo\e być ponownie przeprowadzone w postać rozpuszczoną, gdy jego
cząsteczki ponownie uzyskają swój ładunek elektryczny. Dzieje się tak po rozcieńczeniu
osadu wodą.
Wykonanie oznaczenia:
Do probówki zawierającej ok. 0,5 ml roztworu białka dodaje się taką samą ilość nasyconego
roztworu MgSO4. Wytrąca się biały osad, który rozpuszcza się po dodaniu wody.
6
DENATURACJA BIAAKA
Denaturacja polega na trudno odwracalnej lub nieodwracalnej zmianie struktury II- i III-
rzędowej białka. Zachodzi pod wpływem ró\nych czynników jak: podwy\szona temperatura,
kwasy, zasady, niektóre odczynniki 95% etanol, aceton.
Wykonanie oznaczenia:
a) probówkę zawierającą ok. 0,5 ml roztworu białka umieścić we wrzącej łazni wodnej.
Powstaje biały osad, który jest nierozpuszczalny w wodzie.
b) do probówki zawierającej ok. 0,5 ml roztworu białka dodać ok. 0,5 ml etanolu. Po kilku
minutach wytrąca się osad.
Analiza spektralna aminokwasów
Analizę spektralną aminokwasów wykonuje się w oparciu o zasady przedstawione dla
związków posiadających określone wiązania i/lub grupy funkcyjne. Nale\y przy tym zwrócić
uwagę, \e aminokwasy oprócz typowych grup funkcyjnych (tj. grupy aminowej i
karboksylowej) posiadają szereg innych ugrupowań, które mogą zmieniać właściwości
spektroskopowe poszczególnych związków.
Aminokwasy spotyka się w trzech postaciach: wolnego aminokwasu (jon obojnaczy), lub soli
utworzonych przez grupę karboksylową lub aminową. Postacie te, z uwagi na odmienny
charakter chemiczny, mogą ró\nić się właściwościami, a co za tym idzie dawać ró\ne widma.
1. Spektroskopia w podczerwieni (IR)
Charakterystyczne dla aminokwasów pasma absorpcyjne w IR:
Charakterystycznepasmaabsorpcji Rodzajdrgań
(cm-1)
3400-2600 N H rozciągające
3300-2800 O H rozciągające
1660-1590 N H deformacyjneasymetryczne
1550-1480 N H deformacyjnesymetryczne
1755-1730 C=O rozciągajace
2. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (1H-NMR i 13C-NMR)
1
W widmie H-NMR aminokwasów poza protonami łańcucha węglowego lub układu
aromatycznego pojawia się pojedynczy sygnał protonów grupy -NH2, charakteryzujący się
zmiennością poło\enia (jego poło\enie zale\y między innymi od tego w jakiej postaci
występuje aminokwas) i sygnał pochodzący od protonu grupy COOH przy bardzo wysokich
wartościach przesunięcia chemicznego 10-12 ppm.
13
Analiza widma C-NMR opiera się na znajomości wartości przesunięć chemicznych
poszczególnych węgli budujących konkretny aminokwas np. węgle łańcucha
węglowodorowego, węgle ugrupowań aromatycznych, węgle grupy karboksylowej itd.
7
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Aminokwasy i białka wykład (2)Klucz do testu Aminy, amidy, aminokwasy, białka i sacharydy(1)AMINOKWASY I BIAŁKA BUDOWA WLASCIWOSCI I FUNKCJEAminokwasy Białka M GAminokwasy i białkaĆWICZENIE 1 aminokwasy, białka, sacharydy9 aminokwasy i białka materiałyAminokwasy i białkasprawozdanie białka i aminokwasyChemia 6 Aminokwasy Peptydy i Białkawięcej podobnych podstron