Warszawa, listopad 2007
ENZYMOLOGIA
Materiały do ćwiczeń
opracował zespół Zakładu Regulacji Metabolizmu Instytutu Biochemii
Wydziału Biologii UW
Ćwiczenia są przeznaczone dla studentów biologii i biotechnologii Wydziału Biologii oraz dla
studentów MISMaP.
Zestaw zadań praktycznych
strona
1. Wyznaczanie stałej Michaelisa i szybkoSci maksymalnej dla
dehydrogenazy L-mleczanowej 2
2. Otrzymywanie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z drożdży piwnych.
Sporządzenie bilansu oczyszczania białka enzymatycznego 7
3. Wykorzystanie tyrozynazy otrzymywanej z pieczarki dwuzarodnikowej
do produkcji L-DOPA 12
4. Izolacja i oznaczanie aktywnoSci fosforylazy z ziemniaków 18
5. Oznaczanie aktywnoSci wieloenzymowego układu fotosyntetycznego 21
6. Oznaczenie aktywnoSci immobilizowanej inwertazy 25
7. Analiza elektroforetyczna produktów trawienia histonu H1 papainą 28
1
WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA I SZYBKORCI MAKSYMALNEJ
DLA DEHYDROGENAZY L-MLECZANOWEJ
W czasie trwania każdej reakcji enzymatycznej można wyróżnić trzy fazy. Pierwsza z nich, faza prestacjonarna
(I) trwa kilka milisekund i rozpoczyna się z chwilą dodania enzymu do mieszaniny inkubacyjnej. Następuje
wtedy szybkie tworzenie kompleksu enzym-substrat ES i spadek stężenia wolnego enzymu E. Druga faza,
stacjonarna (II) trwa wystarczająco długo, aby możliwy był pomiar szybkoSci reakcji metodami powszechnie
stosowanymi w laboratoriach biochemicznych. Charakterystyczne cechy fazy stacjonarnej to stała szybkoSć
reakcji, stałe stężenie kompleku ES i enzymu E. Gdy stężenie substratu obniży się na tyle, że zacznie obniżać
się stężenie kompleku ES i spada szybkoSć reakcji, zaczyna się trzecia, poststacjonarna (III) faza reakcji.
Zmiany ztężenia substratu [S], produktu [P], wolnego enzymu [E] i kompleksu enzym-substrat [ES] w
czasie trwania jednosubstratowej reakcji enzymatycznej.
Fazy reakcji enzymatycznej: I - prestacjonarna, II - stacjonarna, III - poststacjonarna.
Założenia teorii Briggsa-Haldena, rozszerzającej postulaty Michaelisa i Menten, dotyczą właSnie fazy
stacjonarnej reakcji enzymatycznej. W fazie stacjonarnej przyrostowi stężenia produktu towarzyszy
równomolowy spadek stężenia substratu a szybkoSć reakcji zależy od stężenia kompleksu ES (wzór *), gdzie
[S] i [ES] oznacza stężenia substratu i kompleksu enzym-substrat a k+2 jest stałą rozpadu kompleksu ES.
W czasie trwania fazy stacjonarnej ustala się stan równowagi dynamicznej rozpadu i tworzenia kompleksu ES
(wzór **).
Równanie kinetyczne reakcji chemicznej można przedstawić jako zależnoSć opisującą szybkoSć reakcji od
zmian stężenia reaktantów. Równanie Michaelisa-Menten oparte jest na tej zasadzie opisu procesów
kinetycznych. Wyznaczenie stałych kinetycznych wymaga zmierzenia, w fazie stacjonarnej reakcji,
2
początkowych szybkoSci reakcji enzymatycznej (V) przy znanych wartoSciach początkowych stężeń substratu
([S]).
SzybkoSć maksymalną reakcji Vmax i stałą Michaelisa Km wyznacza się przy użyciu metod przekształcających
równanie Michaelisa-Menten z zależnoSci hiperbolicznej w prostoliniową. NajczęSciej stosowana jest metoda
Lineweavera-Burke'a, gdzie zastosowano odwrotnoSć równania podstawowego (I). Istnieje wiele przekształceń
równania Michaelisa-Menten umożliwiających proste graficzne wyznaczenie stałych kinetycznych np. metoda
Hofstee-Eadie'go (II), czy metoda Hanesa (III). Dokładne wyznaczenie stałej Michaelisa (Km) i szybkoSci
maksymalnej (Vmax) na podstawie początkowych szybkoSci reakcji (V) i początkowych stężeń substratu [S]
umożliwia metoda Eisenthala i Cornish-Bowdena (IV). W tej metodzie należy wykreSlić proste łączące wartoSci
szybkoSci początkowych (V) odłożone na dodatniej osi 0Y z wartoSciami początkowych stężeń substratu [S]
odłożonych na ujemnej osi 0X. Współrzędne punktu ich przecięcia to wartoSci Vmax (oS 0Y) i Km (oS 0X).
(I)
(II)
(III)
(IV)
Równanie kinetyczne reakcji chemicznej można także przedstawić jako zależnoSć opisującą zmiany stężenia
reaktantów w czasie. Jednym ze sposobów analizy kinetycznej całej krzywej przebiegu reakcji enzymatycznej
są metody posługujące się scałkowaną w przedziale czasowym [t0=0, t] postacią równania szybkoSci reakcji
enzymatycznej, tak jak zaproponowana przez Walkera i Schmidta:
(V)
gdzie [P] to stężenie produktu w czasie t, zaS [S0] to początkowe stężenie substratu.
Wzór (V) można łatwo przekształcić do postaci umożliwiającej łatwe wyznaczenie wartoSci Km i Vmax:
3
(VI)
gdzie [S0] to stężenie początkowe substratu, zaS [S] to stężenie substratu po czasie t.
Używana w doSwiadczeniu dehydrogenaza L-mleczanowa (EC 1.1.1.27 ) jest jednym z enzymów glikolizy
katalizującym reakcję:
CH3 CH3
* *
H)C)OH + NAD+ C4O + NADH + H+
* *
COOH COOH
Materiały i odczynniki (sporządzić na wodzie dejonizowanej o przewodnioSci nie większej niż 3 S)
1. 0,07 M potasowy bufor fosforanowy pH 6,6. Przygotować 100 ml buforu.
2. 3,2 M roztwór siarczanu amonowego.
3. 20 mM roztwór pirogronianu sodu. Przygotować 10 ml roztworu. Oznaczyć dokładnie stężenie roztworu
pirogronianu sodu metodą enzymatyczną (patrz Wykonanie).
4. Roztwór NADH zawierający 20 mg nukleotydu rozpuszczonego w 1 ml H2O (przygotowana naważka
nukleotydu).
5. Roztwór dehydrogenazy L-mleczanowej w 3,2 M siarczanie amonowym (preparat handlowy).
Materiały pomocnicze i aparatura
Kuwety szklane 2 ml, małe bagietki plastikowe, regulowane pipety automatyczne, łaxnia lodowa, stoper.
Spektrofotometr.
Wykonanie
Roztwory enzymu, NADH i pirogronianu należy umieScić w łaxni lodowej, a wszystkie pomiary
przeprowadzać w stałej temperaturze 25oC gdy spektrofotometr posiada termostat lub w zanotowanej
temperaturze pokojowej.
A. Oznaczanie stężenia pirogronianu
Do kuwety pomiarowej odmierzyć :
- 1,4 ml potasowego buforu fosforanowego
- taką iloSć roztworu NADH aby absorpcja mieszaniny reakcyjnej wyniosła od 0,600 do 0,900 (10- 20 l)
- 0,01 ml roztworu pirogronianu, którego początkowe stężenie okreSlono orientacyjnie na 20 mM
- H2O do objętoSci całkowitej 2 ml
ZawartoSć kuwety wymieszać bagietką, następnie preinkubować przez okres 1 minuty, po czym zmierzyć
absorpcję przy długoSci fali 340 nm używając wody jako próby odniesienia (materiałowej). Należy zwrócić
uwagę, aby absorpcja przy długoSci fali 340 nm wynosiła od 0,600 do 0,900. Jeżeli absorpcja odbiega od tej
4
wartoSci to należy zwiększyć lub zmniejszyć iloSć dodawanego roztworu NADH. Zapisać początkową wartoSć
absorpcji. Następnie dodać 5 l roztworu enzymu. Roztwór enzymu odmierzyć pipetą automatyczną na łopatkę
bagietki i przenieSć do kuwety energicznie mieszając. Zmierzyć absorpcję po zakończeniu reakcji. Jeżeli
końcowa absorpcja spadnie poniżej 0,200 należy oznaczenie powtórzyć, używając odpowiednio mniejszej iloSci
pirogronianu.
Do osobnej kuwety odmierzyć wszystkie odczynniki, za wyjątkiem pirogronianu i zmierzyć absorpcję przed
i po dodaniu enzymu. Zmiana absorpcji stanowi poprawkę, którą należy dodać do początkowej wartoSci
absorpcji zmierzonej w próbie badanej (jest to miara zmętnienia roztworu w kuwecie po dodaniu białka
enzymatycznego). Znając milimolowy współczynnik absorpcji dla NADH przy długoSci fali 340 nm
wynoszący 6,22 mM-1 cm-1, wartoSć absorpcji początkowej i końcowej (po zakończeniu reakcji enzymatycznej)
oraz rozcieńczenie badanego roztworu pirogronianu w kuwecie pomiarowej, obliczyć stężenie pirogronianu w
roztworze wyjSciowym.
B. Dobieranie rozcieńczenia enzymu
WyjSciowy roztwór enzymu rozcieńczyć orientacyjnie (wg. wskazań asystenta) w 3,2 M roztworze siarczanu
amonu. Następnie do kuwety odmierzyć:
- 1,4 ml potasowego buforu fosforanowego
- odpowiednią iloSć NADH dającą absorpcję od 0,600 do 0,900
- H2O do objętoSci całkowitej 2 ml
Zmierzyć absorpcję (po wymieszaniu zawartoSci kuwety) przy długoSci fali 340 nm. Następnie dodać 5 l
rozcieńczonego enzymu i zanotować zmiany absorbcji do 60 s preinkubacji (co 15 s). Reakcję rozpocząć
dodaniem w 60 s (czas 0 trwania reakcji) roztworu pirogronianu. Pomiary przeprowadzić przy końcowym
stężenie pirogronianu równym 0,3 mM i 0,01 mM (wykonać dwa powtarzalne pomiary). Roztwór pirogronianu
należy dodawać w objętoSci nie większej niż 50 l. Pomiary przeprowadzać co 15 sekund przez 4 minuty.
Należy pamiętać, aby zanotować wszystkie wartoSci absorbcji; wyjSciową, po dodaniu enzymu i po rozpoczęciu
reakcji dodaniem substratu. Rozcieńczenie enzymu jest odpowiednie, jeżeli spadek absorpcji w pierwszych 60-
100 sekundach pomiaru jest liniowy. Ustalone stężenie enzymu używać do badania kinetyki reakcji
enzymatycznej. Rozcieńczonego enzymu nie należy używać dłużej niż 5 godzin. Przy dużych rozcieńczeniach
dehydrogenazy uwzględnianie poprawki na zmiany absorpcji przez białko enzymu nie jest konieczne.
C. Oznaczenia szybkoSci reakcji przy różnych stężeniach substratu
Do kuwet odmierzyć:
- 1,4 ml potasowego buforu fosforanowego
- odpowiednią iloSć roztworu NADH dającą absorpcję od 0,600 do 0,900
- H2O do objętoSci całkowitej 2 ml
Oznaczenia należy przeprowadzić tak, jak opisano w punkcie 2. Reakcję rozpocząć taką iloScią pirogronianu,
aby stężenie końcowe w kuwecie wynosiło odpowiednio: 0,3; 0,2; 0,1; 0,075; 0,05; 0,02; i 0,01 mM
(ewentualnie wg. wzkazań asystenta). Pomiary należy wykonywać co 15 sekund przez 4 minuty. Należy
wykonać trzy powtarzalne pomiary przy każdym podanym stężeniu pirogronianu.
5
D. Wyznaczanie przebiegu całej krzywej reakcji enzymatycznej
Do kuwet odmierzyć:
- 1,4 ml potasowego buforu fosforanowego
- odpowiednią iloSć roztworu NADH dającą absorpcję od 0,900 do 1,000
- H2O do objętoSci całkowitej 2 ml
Oznaczenia należy przeprowadzić tak, jak opisano w punkcie 2, przy czym użyte rozcieńczenie enzymu
powinno być od półtora do dwóch razy większe niż wyznaczone w punkcie B. Reakcję rozpocząć taką iloScią
pirogronianu, aby stężenie końcowe w kuwecie wynosiło 0,3 mM (ewentualnie wg. wzkazań asystenta). Pomiary
należy wykonywać co 15 sekund aż do całkowitego zakończenia reakcji. Należy wykonać trzy powtarzalne
pomiary.
Obliczenia należy przeprowadzić wykorzystując arkusz kalkulacyjny (QPRO 8.0). Na podstawie otrzymanych
wyników statystycznych przygotować dyskusję błędów przeprowadzonego doSwiadczenia.
RACHUNKOWE WYZNACZANIE WARTORCI SZYBKORCI POCZĄTKOWYCH (V),
SZYBKORCI MAKSYMALNEJ (Vmax) ORAZ STAŁEJ MICHAELISA (Km) DLA
DEHYDROGENAZY MLECZANOWEJ (LDH) PRZY POMOCY ARKUSZA
KALKULACYJNEGO, ZAPROJEKTOWANEGO W PROGRAMIE QUATRO PRO 6.0
Arkusz kalkulacyjny jest graficzną metodą zapisywania i przetwarzania danych liczbowych. Użytkownik ma
do dyspozycji obszar złożony z pól (komórek) z których każda posiada nazwę (adres) składającą się z litery i
cyfry, np. adres A5 oznacza, że komórka położona jest w pierwszej kolumnie i piątym rzędzie arkusza. W każdą
komórkę można wpisać liczbę, która w ten sposób zostaje przyporządkowana okreSlonemu adresowi. Na
przykład, wpisując liczbę 0.897 w komórkę znajdującą się w pierwszej kolumnie i piątym rzędzie arkusza
nadajemy tej liczbie adres A5. W komórkę można także wpisać wzór matematyczny lub statystyczny,
przeliczający liczby wpisane w inne komórki. I tak wpisany w komórkę C5 wzór (A5+B5) dodaje liczby wpisane
w komórki A5 i B5 a wynik zapisuje w komórce C5. W komórki arkusza można także wpisywać dowolny tekst
lub inne elementy graficzne zwiększające czytelnoSć zawartych w nim danych. Wskazanie odpowiednich
komórek (adresów) pozwala także na automatyczne tworzenie wykresów różnego typu. Należy pamiętać, że
wpisanie wartoSci lub wzoru do nieodpowiedniej komórki powoduje otrzymanie błędnego rozwiązania.
Przed wprowadzeniem danych sprawdzić format zapisu liczb.
Do wykonania obliczeń stałych kinetycznych został przygotowany arkusz kalkulacyjny o nazwie 2007_KIN(n),
gdzie n jest liczbą przyporządkowaną użytkownikowi, ponieważ każdy student zapisuje i zapamiętuje wyniki
swoich doSwiadczeń w osobnym zbiorze. Należy wprowadzić wartoSci absorpcji w komórki odpowiadających
czasom i powtórzeniom pomiarów. Na podstawie wartoSci odchylenia standardowego ocenić powtarzalnoSć
wyników. Następnie z odcinka prostoliniowego wykresu absorpcja/czas policzyć metodą regresji liniowej
szybkoSć reakcji. Otrzymane wartoSci wpisać do odpowiednich komórek arkusza i obliczyć wartoSci stałych
kinetycznych. Na podstawie wykresów i wartoSci błędów pomiarów przeprowadzić dyskusję otrzymanych
wyników.
6
OTRZYMYWANIE DEHYDROGENAZY GLUKOZO-6-FOSFORANOWEJ Z
DROŻDŻY PIWNYCH
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, której koenzymem jest NADP, katalizuje reakcję utleniania
glukozo-6-fosforanu do kwasu 6-fosfoglukonowego:
Glukozo-6-fosforan + NADP+ kwas 6-fosfoglukonowy + NADPH + H+
Preparaty dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej są stosowane do enzymatycznego oznaczania
glukozo-6-fosforanu i NADP lub, w obecnoSci heksokinazy, do oznaczania ATP:
heksokinaza
ATP + glukoza <4444444444444> ADP + glukozo-6-fosforan
dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa
Glukozo-6-fosforan+NADP+<44444444444444444444444444444
44444444444444444444444> kwas 6-fosfoglukonowy+NADPH+ H+
Z reakcji tej wynika, że 1 mol utworzonego NADPH odpowiada 1 molowi glukozo-6-fosforanu lub ATP.
Preparat enzymu oczyszcza się z autolizatu drożdży piwnych poprzez wysalanie siarczanem amonowym i
adsorpcję na żelu fosforanowym.
Materiały i odczynniki
1. Autolizat drożdżowy, przygotowany z wysuszonych drożdży piwnych.
2. 0,1 M NaHCO3. Przygotować 100 ml roztworu.
3. Żel fosforanowy. 50 ml roztworu CaCl2 (132g CaCl2x6H2O w 1l) rozcieńczyć wodą do końcowej objętoSci
500 ml i dodać 50 ml roztworu fosforanu trójsodowego (152g Na3PO4x12H2O w 1 dcm3). pH mieszaniny
doprowadzić 1N kwasem octowym do wartoSci 7,4. Powstały osad fosforanu wapnia przemyć szeScioma
półlitrowymi porcjami wody destylowanej o temperaturze pokojowej. Następnie odwirować przy 3000
obr/min przez 10 min. OkreSlić suchą masę (zawartoSć fosforanu wapnia w żelu) poprzez wysuszenie w
temperaturze 105oC próbki żelu o znanej masie.
4. Siarczan amonowy, wysuszony w 50oC i zmielony. Przygotowany na początku ćwiczeń.
5. 0,1 M potasowy bufor fosforanowy pH 7,5. Przygotować 150 ml buforu.
6. 0,1 M bufor Tris-HCl pH 7,5. Przygotować 50 ml buforu.
7. 0,2 M MgCl2. Przygotować 25 ml roztworu.
8. 10 mM glukozo-6-fosforan, bardzo nietrwały (przygotowany w jednorazowych porcjach, przechowywać w
lodzie).
9. 1,5 mM roztwór NADP (przygotowany w jednorazowych porcjach, przechowywać w lodzie)
7
Wykonanie
A. Otrzymywanie enzymu z drożdży piwnych.
Uwaga; studenci rozpoczynają oczyszczanie enzymu począwszy od etapu III.
ETAP I. Przygotowanie suchych drożdży
Gęstwę drożdży piwnych zalać równą jej objętoScią zimnej wody z kranu i po 2-3 godzinach zdekantować.
CzynnoSci te powtarzać wielokrotnie w ciągu dnia, przez trzy kolejne dni. Następnie zdekantowaną gęstwę
odwirować przez 60 min. przy 3500 x g . Supernatant odrzucić, a osad rozłożyć porcjami na tacy wyłożonej
bibułą i pozostawić do wysuszenia pod wentylatorami w temperaturze pokojowej, stopniowo rozdrabniając
grudy drożdżowe. Po wysuszeniu drożdże rozdrobnić w młynku elektrycznym i przesiać przez sito 0,6 mm.
ETAP II. Autolizat drożdżowy
25 g suchych, zmielonych drożdży zawiesić w 75 ml 0,1 M NaHCO3 i pozostawić w łaxni wodnej o
temperaturze 40oC przez 4 godz., delikatnie mieszając. Zawiesinę odwirować przez 50 min. przy 18 000 x g.
Supernatant przechowywać zamrożony w temp. -20oC.
ETAP III. Wysalanie siarczanem amonu
Pobrać 0,5 ml autolizatu do oznaczenia białka i aktywnoSci enzymatycznej. Ze względu na oszczędnoSć czasu
nie należy wykonywać oznaczeń na bieżąco. Próby z poszczególnych etapów oczyszczania (także próby
autolizatu) przechowywać w zamrażalniku lodówki i wszystkie oznaczyć jednoczeSnie.
Frakcjonowanie siarczanem amonu. Wszystkie następne czynnoSci wykonywać w temp. 2oC (łaxnia lodowa).
Otrzymany autolizat (30 ml) rozcieńczyć czterokrotnie w 0,1 M NaHCO3, a następnie powoli, ciągle mieszając
(mieszadło magnetyczne), dodać taką iloSć stałego suchego siarczanu amonu aby otrzymać roztwór o stężeniu
(NH4)2SO4 równym 55% roztworu nasyconego. Mieszaninę odwirować przez 10 minut przy 15000 x g, osad
odrzucić a supernatant wysolić dodając siarczan amonu do wartoSci równej 64% roztworu nasyconego.
Zawiesinę odwirować jak poprzednio i otrzymany osad rozpuScić w 34 ml wody destylowanej. Pobrać 0,5 ml
do oznaczenia białka i aktywnoSci.
ETAP IV. Adsorpcja na żelu fosforanowym
Do 33 ml żelu rozcieńczonego wodą destylowaną (0.02 g fosforanu wapnia w 1 ml roztworu) dodać, ciągle
mieszając, roztwór preparatu enzymatycznego otrzymany w poprzednim etapie (33 ml). Delikatnie mieszać
zawiesinę przez 15 min. Żel z zaadsorbowanym enzymem odwirować (10 min, 1000 x g), supernatant odrzucić,
a do osadu dodać, stale mieszając 66 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,5. Po 10 min. żel odwirować jak
wyżej, osad odrzucić. Supernatant po pobraniu próby do oznaczeń (1 ml) poddać dalszemu oczyszczaniu.
ETAP V. Frakcjonowanie siarczanem amonu
Do eluatu powoli dodać, ciągle mieszając, siarczan amonu do wartoSci równej 60% całkowitego nasycenia
roztworu. Zawiesinę odwirować przez 10 min. przy 15000 x g, osad odrzucić, a supernatant wysolić dodając
siarczan amonu do wartoSci równej 75% nasycenia roztworu. Zawiesinę odwirować jak wyżej a otrzymany osad
rozpuScić w 0.5-1 ml oziębionej wody destylowanej. W roztworze oznaczyć białko i aktywnoSć enzymu.
8
Obliczenia rachunkowe
Wzór umożliwiający przeliczenie przySpieszenia liniowego wyrażonego w wielokrotnoSci g na liczbę obrotów
wirówki wyrażoną w rpm (liczba obrotów na minutę):
z - przySpieszenie liniowe (wielokrotnoSć przySpieszenia ziemskiego, g = 9,81 m s-2)
ł - przySpieszenie kątowe
r - promień rotora (minimalny, Sredni, maksymalny) (w cm)
rpm - liczba obrotów na minutę dla danej wirówki i rotora
w wirówkach z przekładnią firmy Janetzki otrzymaną wartoSć rpm dla rotora należy podzielić przez 4.7.
Wzór umożliwiający wyliczenie iloSci siarczanu amonu potrzebną do otrzymania roztworu o stężeniu będącym
ułamkiem roztworu nasyconego:
g - iloSć gramów siarczanu amonu
V - objętoSć początkowa (ml)
S1 - nasycenie początkowe (ułamek dziesiętny)
S2 - nasycenie końcowe (ułamek dziesiętny)
Z - iloSć gramów w roztworze nasyconym (53.3 g dla siarczanu amonu)
p - przyrost objętoSci (0.3 dla siarczanu amonu)
B. Oznaczanie aktywnoSci dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej
Oznaczenie polega na pomiarze szybkoSci wzrostu absorpcji przy długoSci fali 340 nm spowodowanym
redukcją NADP w obecnoSci dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. Do kuwety o przekroju 1 cm i pojemnoSci
2 ml odmierzyć następujące iloSci roztworów (w ml):
Bufor Tris-HCl MgCl2 NADP Glukozo-6-fosforan Woda
0,75 0,1 0,2 0,1 0,35
Następnie dodać pipetą automatyczną od 5 do 30 l enzymu (wg. wskazań asystenta) i po wymieszaniu
odczytywać wartoSci absorpcji co 15 sekund przez 3 minuty. Jako próbę odniesienia stosować wodę
destylowaną. Oznaczenie powtórzyć z taką samą iloScią enzymu. Sporządzić wykres zmiany absorpcji w czasie
i obliczyć zmianę absorpcji w ciągu 1 minuty. Na tej podstawie obliczyć iloSć przereagowanego
glukozo-6-fosforanu.
Milimolowy współczynnik absorpcji dla NADPH przy długoSci fali 340 nm wynosi 6,22 mM-1 cm-1.
9
C. Opracowanie wyników
Po oznaczeniu stężenia białka i aktywnoSci w próbach z poszczególnych etapów oczyszczania sporządzić
bilans oczyszczania enzymu wg wzoru:
ETAP ObjętoSć Stężenie całkowite Całkowita zawartoSć AktywnoSć AktywnoSć WydajnoSć Stopień
białka* białka całkowita właSciwa oczyszczenia
ml mg/ml mg U U/mg % %
Orientacyjne, całkowite stężenia białka po kolejnych etapach oczyszczania enzymu (w mg/ml) wynosi: autolizat
10-100, pierwsze wysalanie 10-100, adsorpcja na żelu 1-10, drugie wysalanie 1-10.
10
OZNACZANIE BIAŁKA METODĄ BRADFORD
Metoda oznaczenia polega na pomiarze wzrostu absorpcji przy długoSci faki 595 nm, wywołanego powstaniem
kompleksu barwnika Coomassie Blue G-250 z białkiem.
Odczynniki
1. Odczynnik Bradford (przygotowany). 100 mg Coomassie Blue G-250 rozpuScić w 50 ml 96% etanolu.
Do tego roztworu dodać 100 ml 85% (wag/obj) kwasu ortofosforowego. Otrzymany roztwór rozcieńczyć
wodą destylowaną do objętoSco końcowej 1 dcm3. Przechowywać w ciemnej butelce w lodówce.
2. Roztwór wzorcowy białka 0,250 mg/ml w 1 M NaOH
3. 50% metanol lub aceton
4. 1 M roztwór NaOH
Wykonanie
A. Wyznaczanie krzywej wzorcowej (przygotowana)
Przygotować 11 czystych, suchych i ponumerowanych probówek na 10 ml. Do probówki nr 1 dodać pipetą
automatyczną 100 l 1 M NaOH. Do pozostałych probówek dodać, w dwóch powtórzeniach, 20, 40, 60, 80 i
100 l wzorcowego roztworu białka w 1M NaOH. Roztwory białka w probówkach uzupełnić 1 M NaOH do
objętoSci 100 l. Następnie do każdej probówki dodać po 1,5 ml odczynnika Bradforda i wymieszać zawartoSć
na mikromieszadle. Po upływie 15 min. zmierzyć absorpcję prób przy długoSci fali 595 nm, stosując roztwór
z probówki nr 1 jako próbę odniesienia. Należy używać czystych, przepłukanych 50% metanolem kuwet.
Pomiarów dokonywać począwszy od prób o najmniejszym stężeniu białka. Na podstawie uzyskanych wyników
wykreSlić krzywą wzorcową, odkładając na osi odciętych wartoSci absorpcji (A), a na osi rzędnych zawartoSć
białka w próbie (w g). Obliczyć metodą najmniejszych kwadratów współczynnik nachylenia prostej regresji
dla odcinka prostoliniowego.
B. Oznaczanie białka w próbie
Próbę rozcieńczyć 1 M NaOH tak aby zawartoSć białka wynosiła od 5 do 25 g białka, a końcowa objętoSć
roztworu nie była większa niż 100 l. Rozcieńczoną próbę odmierzyć za pomocą pipety automatycznej do
suchej probówki na 10 ml. W razie potrzeby objętoSć doprowadzić do 100 l roztworem 1 M NaOH, dodać 1,5
ml odczynnika Bradford, zamieszać i po 15 minutach zmierzyć absorpcję przy 595 nm wobec próby nie
zawierającej białka (tzw. materiałowej lub odniesienia). Jeżeli iloSć białka wzięta do oznaczania była
odpowiednia (absorpcja 0,1 - 0,5), oznaczenie powtórzyć jeszcze 2 razy. Z krzywej wzorcowej odczytać iloSć
białka w próbie badanej i na tej podstawie obliczyć jego zawartoSć w próbie wyjSciowej.
11
WYKORZYSTANIE TYROZYNAZY OTRZYMYWANEJ Z PIECZARKI
DWUZARODNIKOWEJ (AGARICUS BISPORUS) DO PRODUKCJI L-DOPA
L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) jest naturalnym prekursorem dopaminy, jednego z najważniejszych
neurotransmitterów wykorzystywanych przez neurony ssaków, a także adrenaliny i noradrenaliny,
syntetyzowanych zarówno w oSrodkowym układzie nerwowym jak i w tkankach obwodowych [Carlsson, 2001].
W większoSci komórek zdolnych do syntezy amin katecholowych, L-DOPA jest wytwarzana z tyrozyny w
reakcji katalizowanej przez hydroksylazę tyrozynową (TH, Rys. 1), a następnie przekształcana w dopaminę
przez dekarboksylazę DOPA (AADC). Dopamina może być następnie wykorzystana do syntezy noradrenaliny
i adrenaliny w reakcjach katalizowanych przez hydroksylazę dopaminową oraz N-metylotransferazę
fenyloetanoloaminową (PNMT).
Rys. 1. Schemat biosyntezy amin katecholowych w organizmie człowieka
L-DOPA jest podstawowym i najbardziej skutecznym Srodkiem stosowanym w terapii choroby Parkinsona
schorzenia zwyrodnieniowego układu nerwowego, na które cierpi około 1,5 % osób w wieku powyżej 65 lat.
Przyczyny choroby Parkinsona nie zostały dotychczas w pełni wyjaSnione, aczkolwiek wiadomo, że
obserwowane objawy: drżenie rąk, ramion, nóg żuchwy i twarzy, sztywnoSć kończyn i tułowia, spowolnienie
ruchów, upoSledzenie koordynacji ruchowej i równowagi są wynikiem obumieranie neuronów istoty czarnej
mózgu (tzw. neuronów dopaminergicznych) odpowiedzialnych za produkuję dopaminy [Samii i wsp., 2004].
Podstawową metodą produkcji L-DOPA w przemySle farmaceutycznym jest synteza chemiczna [Ho i wsp.,
2003]. W latach 90-tych minionego wieku nasiliły się badania nad wykorzystaniem mikroorganizmów lub
preparatów enzymatycznych w produkcji tego leku. Jednak biosynteza L-DOPA z użyciem bakterii lub grzybów
okazała się doSć kosztowna, głównie ze względu na koniecznoSć usuwania dużych iloSci zanieczyszczeń
powstających w procesie produkcyjnym, a przez to niekonkurencyjna z syntezą chemiczną. Z drugiej strony,
12
prace nad wykorzystaniem enzymu tyrozynazy, jako biokatalizatora reakcji przekształcania aminokwasu
tyrozyny w L-DOPA wskazały na wyraxną opłacalnoSć ekonomiczną takiego podejScia, szczególnie w Swietle
dużej trwałoSci enzymu i łatwoSci jego oddzielenia od mieszaniny reakcyjnej.
Tyrozynaza (EC 1.14.18.1) jest enzymem szeroko rozpowszechnionym w organizmach żywych. ObecnoSć tego
enzymu stwierdza się zarówno w mikroorganizmach jak i w komórkach roSlin. Natomiast w organizmach
ssaków największą aktywnoSć tyrozynazy wykrywa się w melanocytach, gdzie jest ona kluczowym enzymem
szlaku syntezy melaniny, barwnika nadającego charakterystyczne zabarwienie skóry.
Tyrozynaza może katalizować dwie różne reakcje chemiczne:
a) hydroksylację monofenoli do o-difenoli:
b) utlenianie o-difenoli do o-chinonów:
SpoSród różnorodnych związków chemicznych o charakterze monofenoli, tyrozyna wydaje się być
najważniejszym substratem tyrozynazy. Enzym ten wydajnie hydroksyluje tyrozynę do L-DOPA (o-difenol,
por. powyżej), a następnie umożliwia przekształcenie cząsteczek L-DOPA do dopachinonów (o-chinon).
Proces powstawania dopachinonów można zablokować przez dostarczenie do Srodowiska reakcji związków
chemicznych o właSciwoSciach silnie redukujących np. askorbinianu lub NADH, co sprawia, że jedynym
produktem reakcji katalizowanej przez tyrozynazę jest L-DOPA. MożliwoSć tę wykorzystuje się w procesie
enzymatycznej produkcji L-DOPA, a pomiar iloSci powstającej L-DOPA w czasie pozwala okreSlić aktywnoSć
użytej tyrozynazy.
Powszechnie stosowaną, czułą i prostą metodą detekcji oraz iloSciowego oznaczania L-DOPA w próbach nie
zawierających innych o-difenoli (np. adernaliny, 2,3-dihydroksybenzoesanu etc.) jest chemiczne przekształcenie
tego aminokwasu do dinitrochinonu. Ponieważ powstały związek charakteryzuje się intensywnym, czerwono-
pomarańczowym zabarwieniem możliwe jest oznaczenie jego zawartoSci metodami kolorymetrycznymi (l=460
nm). Proces derywatyzacji L-DOPA do dinitrochinonu przebiega w dwóch kolejnych reakcjach chemicznych
(Waite i Benedict, 1984; Arnow, 1937):
a) nitrowania L-DOPA do dinitropochodnej o charakterystycznym żółtym zabarwieniu:
13
b) utlenienia dinitropochodnej L-DOPA do dinitrochinonu w obecnoSci jonów wodorotlenowych:
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z enzymatyczną metodą produkcji L-DOPA z wykorzystaniem
tyrozynazy uzyskanej z pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus).
Materiały
200 g Swieżych pieczarek, mrożonych w temperaturze ok. -20C przez 12 godzin.
1. Lejek Bchnera o Srednicy ok. 20 cm oraz krążek bibuły filtracyjnej Whatman No. 1 dopasowany rozmiarem
do lejka, pompka wodna, homogenizator nożowy, waga do równoważenia probówek wirówkowych, wirówka
z chłodzeniem, woreczek do dializy (ok. 40 cm), spektrofotometr Spekol, kuwety spektrofotometryczne.
Odczynniki
1. 1000 ml acetonu schłodzonego do temperatury ok. -20 C
2. 1500 ml 0,1 M sodowego buforu fosforanowego o pH 7,0 schłodzonego do temperatury ok. +4 C
3. 80 ml mieszaniny reakcyjnej do oznaczania aktywnoSci tyrozynazy zawierającej 0,1 M sodowy bufor
fosforanowy pH 7,0, 7,5 mM askorbinian sodu, 2,5 mM tyrozynę
4. siarczan amonu, wysuszony w 50 C przez 24 godz. i zmielony
5. 35 ml 2 M NaOH
6. 30 ml 2 M HCl
7. 20 ml 15 % (w/obj.) roztwóru molibdenianu sodu zmieszanego z 20 ml 15 % (w/obj.) azotynu sodu (NaNO2),
8. 10 mM roztwór wzorcowy L-DOPA. Odważyć bardzo dokładnie naważkę L-DOPA (na 5 ml). Tuż przed
użyciem, rozpuScić w ogrzanej do temp. około 60 C mieszaninie reakcyjnej do oznaczania aktywnoSci
tyrozynazy.
9. Odczynnik Bradford do oznaczania białka (przygotowany)
Wykonanie
A. Otrzymywanie enzymu z pieczarki dwuzarodnikowej
Pokroić 250 g pieczarek na drobne kawałki i umieScić w zamrażalniku lodówki lub zamrażarce na okres 12
godzin.
Etap I. Ekstrakcja białek acetonem
Wszystkie następne czynnoSci wykonywać w temp. 2-4C (w chłodni). Pokrojone i mrożone pieczarki
umieScić w homogenizatorze nożowym, a następnie dodać 300 ml acetonu schłodzonego do temp. ok. -20 C.
Homogenizować 4 impulsami po 15 sekund z krótkimi przerwami (5 sekund), przy niskich ( Low ) obrotach
noży homogenizatora. Uzyskany homogenat przesączyć przez bibułę filtracyjną umieszczoną w lejku Bchnera.
Osiadłą na bibule papkę zebrać i przenieSć ponownie do homogenizatora dodając kolejną porcję 300 ml
schłodzonego acetonu i homogenizować jak wyżej, a następnie powstały homogenat przesączyć na lejku
14
Bchnera. Osiadłą papkę zebrać, zważyć i pobrać około 10 g proszku acetonowego do probówki wirówkowej.
PozostałoSć papki umieScić w homogenizatorze i dodać 220 ml 30% (obj./obj.) roztworu acetonu w schłodzonej,
destylowanej wodzie. Homogenizować 8 impulsami po 15 sekund (2 min.).
Homogenat przenieSć do probówek wirówkowych. Wszystkie probówki zrównoważyć i wirować przez 25 minut
przy 10 000 x g w temp. 0 C. Osad proszku acetonowego w probówce wirówkowej zawiesić w 15 ml 0,1 M
buforu fosforanowego o pH 7,0. Z pozostałych probówek pobrać do cylindra miarowego otrzymany supernatant,
zanotować objętoSć i przelać do zlewki o odpowiedniej objętoSci. Następnie dodać, ciągle mieszając, 1,5
objętoSci acetonu schłodzonego do temp. -20 C i umieScić tak sporządzony roztwór w zamrażarce do czasu
utworzenia się wyraxnego osadu (1 -2 godz.). Powstałą zawiesinę białka oraz wczeSniej oddzielony proszek
acetonowy w buforze fosforanowym odwirować jak wyżej. Supernatant odrzucić, a osad rozpuScić w 18 ml 0,1
M sodowego buforu fosforanowego (pH 7,0) schłodzonego do temp. +4 C. Pobrać do oddzielnej probówki
3 ml roztworu w celu oznaczenia białka i aktywnoSci tyrozynazy. Próbkę przechowywać w stanie
zamrożonym do czasu wykonywania oznaczeń.
Etap II. Frakcjonowanie białek siarczanem amonu
Wszystkie następne czynnoSci wykonywać w temp. ok. 2C (łaxnia lodowa). Otrzymany ekstrakt rozcieńczyć
dwukrotnie dodając 15 ml schłodzonego 0,1 M sodowego buforu fosforanowego (pH 7,0). Następnie do
ekstraktu (30 ml) powoli dodawać, ciągle mieszając, stały suchy siarczan amonowy do otrzymania roztworu
o stężeniu końcowym równym 30 % roztworu nasyconego*. Roztwór pozostawić na okres 45 minut w łaxni
lodowej stale mieszając. Następnie odwirować powstałą zawiesinę przez 30 minut przy 10 000 x g w temp. 0 C.
Osad odrzucić, a supernatant wysolić dodając siarczan amonu do wartoSci równej 70 % nasycenia roztworu. Po
45 minutach mieszania w łaxni lodowej, zawiesinę odwirować jak wyżej, otrzymany osad rozpuScić w 8 ml
oziębionego 0,1 M sodowego buforu fosforanowego (pH 7,0). Ponownie pobrać do oddzielnej probówki 3
ml roztworu w celu oznaczenia białka i aktywnoSci tyrozynazy. Próbkę przechowywać w stanie
zamrożonym do czasu wykonywania oznaczeń.
*IloSci siarczanu amonu potrzebną do otrzymania roztworu o stężeniu będącym ułamkiem roztworu nasyconego
obliczyć z następującego wzoru:
g = [z V/100] [(S2-S1)/1-(p S2)]
g - iloSć gramów siarczanu amonu
V - objętoSć początkowa (ml)
S1 nasycenie początkowe (ułamek dziesiętny)
S2 nasycenie końcowe (ułamek dziesiętny)
Z iloSć gramów w roztworze nasyconym (53,3 g dla siarczanu amonu)
p przyrost objętoSci (0,3 dla siarczanu amonu)
Etap III. Dializa
Pozostałą iloSć roztworu otrzymanego w poprzednim etapie przelać do woreczka dializacyjnego. Dializę
prowadzić względem 0,1 M sodowego buforu fosforanowego (pH 7,0, ok. 1000 ml) przez 6-12 h w temp. 2-4 C
przy ciągłym mieszaniu buforu (mieszadło magnetyczne). Preparat zamrozić.
15
B. Oznaczanie aktywnoSci tyrozynazy - produkcja L-DOPA
Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczeń L-DOPA
Do 7 jednorazowych, plastykowych i ponumerowanych probówek odmierzyć następujące iloSci roztworów
(w l):
Probówka
0 1 2 3 4 5 6
10 mM
0 10 20 40 60 80 100
L-DOPA
*Mieszanina 1000 990 980 960 940 920 900
*Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywnoSci tyrozynazy
Przy użyciu pipety automatycznej dodać do każdej probówki po: 500 l 2 M HCl oraz 1000 l mieszaniny 15
% molibdenianu sodu z 15 % azotynem sodu. Następnie zawartoSć probówek zamieszać na mikrowytrząsarce,
dodać po 1000 l 2 M NaOH i ponownie zamieszać. Po 5 minutach zmierzyć wartoSci absorbancji przy =460
nm względem próby odniesienia (probówka 0 ). Na podstawie uzyskanych wyników wykreSlić krzywą
wzorcową, odkładając na osi rzędnych wartoSci absorpcji (A), a na osi odciętych zawartoSć L-DOPA w próbie
(w mol).
Oznaczanie aktywnoSci tyrozynazy
4 zlewki o poj. 25 ml (podpisane I, II, III oraz IV) napełnić 15 ml mieszaniny reakcyjnej do oznaczania
aktywnoSci tyrozynazy. W zlewkach umieScić mieszadełko magnetyczne, zapewnić regularne i jak najwolniejsze
obroty(użyć mieszadła czteropozycyjnego). Przygotować 4 zestawy probówek po 7 sztuk wg schematu i
odpipetować do każdej probówki po 500 l 2 M HCl. Reakcję rozpoczyna się dodaniem preparatów enzymów:
1) proszek acetonowy do zbiornika I (2 ml); 2) przed wysoleniem do zbiornika II (1 ml); 3) po wysoleniu
do zbiornika III (1 ml) oraz 4) po dializie do zbiornika IV (1 ml)
Zestaw probówek dla prób
pobieranych ze zbiornika X
X0 X20 X40 X60 X80 X100 X120
Jako X opowiednio oznaczono I, II, III lub IV
W celu oznaczenia produkcji L-DOPA pobierać co 20 minut po 1000 l próby z każdej zlewki i przenosić do
uprzedni przygotowanych probówek zawierających 2 M HCl. Po zakończeniu reakcji dodać po 1000 l
mieszaniny 15 % molibdenianu amonu z 15 % azotynem sodu. ZawartoSć probówek zamieszać na
mikrowytrząsarce i do każdej dodać po 1000 l 2 M NaOH i ponownie zamieszać. Po 5 minutach zmierzyć
wartoSci absorbancji przy =460 nm względem odpowiedniej próby pobranej w czasie 0 .
C. Oznaczanie zawartoSci białka metodą Bradford
ZawartoSć białka w pobranych próbach oznaczyć metodą Bradford (patrz opis przygotowania krzywej
wzorcowej i przeprowadzenia oznaczeń str. 11). Orientacyjne, całkowite stężenia białka po kolejnych etapach
oczyszczania enzymu (w mg/ml) wynosi: Etap I : 1,5 - 5, Etap II: 5 -10, Etap III: 5 - 10, Etap IV: 5 - 10.
16
D. Opracowanie wyników
Na podstawie wykonanych pomiarów zawartoSci białka i aktywnoSci w próbach z poszczególnych etapów
oczyszczania sporządzić bilans oczyszczania enzymu wg wzoru:
Etap ObjętoSć Stężenie Całkowita AktywnoSć AktywnoSć WydajnoSć Stopień
całkowite białka zawartoSć białka całkowita właSciwa oczyszczenia
ml mg/ml mg U U/mg % %
17
IZOLOWANIE I OZNACZANIE AKTYWNORCI FOSFORYLAZY Z ZIEMNIAKÓW
Polisacharydy są związkami bardzo powszechnie występującymi w przyrodzie. Zbudowane są z powtarzalnych
jednostek składających się z jednego do siedmiu monosacharydów. Początkowo polisacharydy były postrzegane
jedynie jako materiał strukturalny i zapasowy. Gdy okazało się, że modyfikowane polimery węglowodanów
mogą mieć różne zastosowania komercyjne, (np. we włókiennictwie, rolnictwie, czy kosmetyce) zainteresowanie
nimi znacznie wzrosło. Najprostsze polimery są utworzone przez identyczne, nie modyfikowane reszty pentoz
lub heksoz połączonych takimi samymi wiązaniami. Przykładami takich polimerów są: amyloza zbudowana z
reszt D-glukozy połączonych wiązaniami a-1,4-glikozydowymi oraz laminaryna zbudowana z reszt D-glukozy
połączonych wiązaniami -1,3-glikozydowymi. Amylozę można syntetyzować w reakcji katalizowanej przez
fosforylazę z ziemniaka, gdyż substratem tej reakcji jest glukozo-1-fosforan, a jako starter służy maltoheptoza.
Celem ćwiczenia jest otrzymanie fosforylazy z ziemniaka, oznaczenie jej aktywnoSci i sporządzenie bilansu
oczyszczania.
Odczynniki
1. Roztwór do homogenizacji: 0,5% podsiarczyn sodowy (Na2S2O4) zawierający 0,5% cytrynianu sodowego
2. Siarczan amonowy, wysuszony w 50 C przez 24 godz. i zmielony
3. 0,5 M Tris-HCl, pH 8
4. 0,1 M bufor cytrynianowy, pH 6
5. 1 M bufor TRA (13.32 ml czystego TRA w końcowej objętoSci 100 ml), pH=6
6. 20 ml 2,5 M kwasu siarkowego
7. 5% roztwór molibdenianu amonowego
8. odczynnik fosforanowy (przygotować tuż przed wykonaniem oznaczenia):
0.2 g p-metyloaminofenolu rozpuScić w 100 ml wody, dodać 1.04 ml wodorosiarczynu sodu, 20 ml
2.5 M kwasu siarkowego i 20 ml 5% molibdenianu amonowego
9. Glukozo-1-fosforan
10. Maltoheptoza
11. KwaSny fosforan sodowy
12. Odczynnik Bradford do oznaczania białka (przygotowany)
A. Otrzymywanie i oczyszczanie preparatu fosforylazy
Etap I. Homogenat z ziemiaka
Około 1 kg obranych i opłukanych ziemniaków zhomogenizować w 100 ml roztworu do homogenizacji w
temperaturze 4oC. Homogenat przesączyć przez 4 warstwy gazy i odwirować przy 4 000 x g przez 30 min. w
temperaturze 4oC. pH otrzymanego supernatantu doprowadzić do wartoSci 7 używając 0,5 M buforu Tris-HCl
o pH=8. Do probówki pobrać 10 ml roztworu w celu oznaczenia białka i aktywnoSci fosforylazy. Próbkę
przechowywać w stanie zamrożonym do czasu wykonywania oznaczeń.
18
Etap II. Denaturacja cieplna
Supernatant ogrzać do temperatury 55oC i inkubować w takich warunkach przez 40 min., a następnie
odwirować przy 4 000 x g przez 30 min (4oC). Do oddzielnej probówki pobrać 10 ml supernatantu w celu
oznaczenia białka i aktywnoSci fosforylazy. Próbkę przechowywać w stanie zamrożonym do czasu
wykonywania oznaczeń.
Etap III. Frakcjonowanie siarczanem amonowym
Otrzymany w poprzednim etapie supernatant należy wysolić siarczanem amonu. W tym celu do otrzymanego
roztworu dodać małymi porcjami 1/10 (wag./obj., 10 g na 100 ml) siarczanu amonu i mieszać w temperaturze
4oC przez 30 minut, a następnie odwirować przy 4 000 x g przez 30 min. Do otrzymanego supernatantu dodać
1/4 (wag./obj., 25 g na 100 ml roztworu) siarczanu amonowego i mieszać przez 30 minut a następnie odwirować
jak wyżej. Otrzymany osad rozpuScić w niewielkiej iloSci wody destylowanej (2-5 ml) i zamrozić.
B. Oznaczanie aktywnoSci fosforylazy
W 50 ml buforu cytrynianowego rozpuScić 11 mg glukozo-1-fosforanu i 7 mg maltoheptozy. Tak
przygotowanej mieszaniny reakcyjnej odmierzyć po 6 ml do próbówek plastikowych o objętoSci 10 ml i wstawić
na około 5 minut do łaxni wodnej nastawionej na temp. 45oC. Następnie rozpocząć reakcję syntezy amylozy
dodaniem 1 lub 2 ml prób pobieranych w kolejnych etapach oczyszczania fosforylazy. ZawartoSć probówek
dobrze wymieszać. Natychmiast po dodaniu ekstraktów pobrać 1 ml próby w czasie 0. Kolejne próby o objętoSci
1 ml pobierać z mieszaniny reakcyjnej w 5, 10, 15, 20, 25 i 30 minutach inkubacji. Reakcję przerwać poprzez
wstawienie prób do łaxni wodnej o temp. 100oC na 10 min. Następnie należy niezwłocznie oznaczyć we
wszystkich próbach zawartoSć fosforanu. Gdy oznaczenie wykonuje się poxniej, próby natychmiast zamrozić.
C. Oznaczanie fosforanu
Pobrane w trakcie inkubacji poszczególnych preparatów fosforylazy próby (punkt B) ogrzewać przez 10 min.
w temperaturze 100oC. Do kolejno ponumerowanych probówek odmierzyć: 50 - 300 l badanej próby, 3,5 ml
odczynnika fosforanowego oraz bufor TRA do końcowej objętoSci 5 ml. CałoSć wymieszać i pozostawić przez
15 minut. Pomiary zawartoSci fosforanu prowadzić przy długoSci fali 578 nm względem próby odniesienia
(1.5 ml TRA i 3.5 ml odczynnika fosforanowego).
D. Przygotowanie krzywej wzorcowej do oznaczenia fosforu
Przygotować szeSć roztworów kwaSnego fosforanu sodowego o objętoSci 10 ml zawierających odpowiednio
następujące iloSci fosforu: 125 g, 250 g, 500 g, 750 g, 1 m g oraz 1,25 mg. Do o ponumerowanych
probówek odmierzyć po 200 l roztworu fosforanu sodowego zawierającego odpowiednią iloSć fosforu, 3,5 ml
odczynnika fosforanowego oraz buforu TRA do końcowej objętoSć 5 ml. CałoSć wymieszać i inkubować przez
15 minut. Pomiary stężenia fosforanu prowadzić przy długoSci fali 578 nm względem próby odniesienia (1.5
ml TRA i 3.5 ml odczynnika fosforanowego). WykreSlić krzywą wzorcową odkładając na osi odciętych iloSci
fosforu w próbie, a na osi rzędnych odpowiadające im wartoSci absorbancji.
E. Oznaczanie zawartoSci białka metodą Bradford
ZawartoSć białka w pobranych próbach oznaczyć metodą Bradford (patrz opis przygotowania krzywej
wzorcowej i przeprowadzenia oznaczeń na str. 11).
19
F. Opracowanie wyników
Na podstawie wykonanych pomiarów zawartoSci białka i aktywnoSci w próbach pobranych w poszczególnych
etapach oczyszczania sporządzić bilans oczyszczania enzymu wg wzoru:
Etap ObjętoSć Stężenie białka Całkowita AktywnoSć AktywnoSć WydajnoSć Stopień
zawartoSć białka całkowita właSciwa oczyszczenia
ml mg/ml mg U U/mg % %
20
OZNACZANIE AKTYWNORCI WIELOENZYMOWEGO UKŁADU
FOTOSYNTETYCZNEGO
A. Izolowanie chloroplastów
W badaniach układów fotosyntetycznych stosuje się powszechnie izolowane chloroplasty. Wybór jednej
spoSród wielu metod preparatywnych zależy od rodzaju planowanych badań. W zależnoSci od stopnia
strukturalnej i funkcjonalnej integralnoSci otrzymanych chloroplastów wyróżnia się kilka ich klas (klasyfikacja
Halla). W wielu badaniach wystarczająca jest prosta technika wirowania różnicowego homogenatu liSci w
izotonicznym zbuforowanym roztworze o odpowiedniej sile jonowej i pH.
Materiały i odczynniki.
1. Rwieże liScie grochu lub szpinaku (20-50g)
2. 50 mM bufor Tris-HCl o pH 7,5 zawierający 0,4 M sacharozę, 40 mM kwas askorbinowy, 20 mM chlorek
sodowy (bufor A). Odważyć sacharozę, kwas askorbinowy, NaCl, odpowiednią iloSć roztworu Tris
odmierzyć ze stężonego roztworu. Po rozpuszczeniu składników, doprowadzić pH kwasem solnym do
wartoSci 7,5. Sporządzić 200 ml roztworu.
3. Bufor B o składzie takim samym jak roztwór A, za wyjątkiem askorbinianu. pH tego roztworu doprowadzić
roztworem HCl do wartoSci 7,0. Przygotować 100 ml roztworu.
4. 20 mM bufor Hepes-NaOH o pH 7,0 zawierający 0,33 M sorbitol, 5 mM NaCl, 4 mM MgCl2 (bufor C)
(przygotowany).
5. 80% wodny roztwór acetonu.
Materiały pomocnicze i aparatura
Fizelina, homogenizator nożowy, wirówka z chłodzeniem, homogenizator Pottera-Elvenhjema,
mikrowytrząsarka, spekol, kuwety szklane.
Wykonanie
Całą preparatykę należy wykonywać szybko w temperaturze nie wyższej niż 4oC (chłodnia) i w przyćmionym
Swietle.
20-50 g liSci grochu lub pozbawionych nerwów głównych liSci szpinaku przemyć wodą destylowaną. LiScie
zhomogenizowac w około 200 ml oziębionego do temperatury ok. 2oC buforu A przez 10 s, przy maksymalnych
obrotach noży homogenizatora. Następnie przesączyć homogenat przez cztery warstwy fizeliny do zlewki
znajdującej się w łaxni lodowej.
Przesącz odwirować w wirówce z chłodzeniem przez 2 minuty przy przySpieszeniu 225 x g. Osad odrzucić,
a supernatant wirować przez 10 minut przy przySpieszeniu 1000 x g. Supernatant odrzucić, a osad chloroplastów
zawiesić w około 100 ml ochłodzonego do ok. 2oC buforu B i odwirować przez 10 minut przy przySpieszeniu
1000 x g. Supernatant zdekantować, a osad chloroplastów zawiesić w homogenizatorze Pottera-Elvenhjema w
jak najmniejszej objętoSci (0,5-1,5 ml) zimnego buforu C.
Zawiesinę chloroplastów przechowywać w ciemnoSci w łaxni lodowej. Oznaczyć stężenie chlorofilu oraz
aktywnoSć fotosyntetycznego transportu elektronów. Jeżeli oznaczeń nie przeprowadza się w dniu preparatyki,
należy zamrozić chloroplasty w plastikowej probówce w temperaturze -80oC. Preparat rozmrażać w 4oC
wytrząsając delikatnie przy pomocy mikrowytrząsarki.
21
B. Oznaczenie stężenia chlorofilu
Do 0,025 ml zawiesiny chloroplastów w probówce dodać 10 ml 80% (v/v) wodnego roztworu acetonu.
ZawartoSć probówek wytrząsać przez około 30 sekund w celu wyekstrahowania chlorofilu i ekstrakt przesączyć
przez bibułę filtracyjną do kuwet szklanych o długoSci drogi Swietlnej 1 cm. Niezwłocznie zmierzyć absorpcję
otrzymanych roztworów przy długoSci fali 652 nm, wobec próby odniesienia zawierającej 80% wodny roztwór
acetonu. W celu obliczenia stężenia chlorofilu (w mg/ml zawiesiny) należy pomnożyć wartoSć absorpcji przez
współczynnik 11,6.
C. Oznaczenie aktywnoSci fotosyntetycznego transportu elektronów
Izolowane chloroplasty katalizują reakcj oksydoredukcyjną uwarunkowaną działaniem Swiatła, w której woda
jest naturalnym donorem elektronów. W fotosyntezie roSlinnej zachodzą dwa rodzaje reakcji Swietlnych :
krótkofalowa wynikająca z aktywnoSci II układu fotosyntezy (PSII) i długofalowa wynikająca z aktywnoSci I
układu fotosyntezy (PSI). AktywnoSć PS II i PS I mierzy się stosując sztuczne donory i akceptory elektronów
odpowiednio dostarczające lub pobierające elektrony w różnych miejscach łańcucha fotosyntetycznego:
HO))))))))> PS II )))))))))))))))))))))> PS I ))))))))))> NADP+
2
* * * *
sztuczny sztuczny sztuczny sztuczny
donor e- akceptor e- donor e- akceptor e-
1 1 2 2
AktywnoSć PSII można mierzyć jako szybkoSć wydzielania tlenu przez chloroplasty. Tlen jest bowiem
produktem reakcji zachodzącej w PSII. Pomiary przeprowadza się używając elektrody tlenowej Clarka. Po
zahamowaniu transportu elektronów pomiędzy sztucznym akceptorem 1 a sztucznym donorem elektronów 2,
w obecnoSci zredukowanej formy donora elektronów 2 można badać aktywnoSć PSI również używając elektrody
tlenowej Clarka. Wykorzystuje się fakt, że zredukowana forma akceptora elektronów 2 ulega samoutlenieniu
z równoczesnym wytworzeniem rodnika ponadtlenkowego, co wymaga udziału tlenu. Reakcja ta nosi nazwę
reakcji Mehlera. Zastosowanie egzogennego akceptora elektronów umożliwia badanie fotofosforylacji
związanej z niecyklicznym transportem elektranów w chloroplastach, mimo że w czasie izolowania organelli
jest usuwana z nich ferredoksyna oraz NADP. W celu okreSlenia stopnia sprzężenia otrzymanego preparatu
chloroplastów mierzy się stymulację szybkoSci niecyklicznego transportu elektronów pod wpływem
egzogennego ADP i fosforanu.
Przez analogię do kontroli oddechowej mitochondriów, stosunek szybkoSci transportu elektronów przed
dodaniem ADP i fosforanu, do szybkoSci transportu elektronów po ich dodaniu, nazwano kontrolą
fotosyntetyczną. Oprócz związków rozprzęgających mitochondrialną i fotosyntetyczną fosforylację niecykliczną,
jak 2,4-dinitrofenol i FCCP (karbonylocyjanek p-trifluorome-toksyfenylohyd-razonu), znane są też związki
rozprzęgające specyficznie fosforylację fotosyntetyczną. Należą do nich jony amonowe.
Do szczegółowego scharakteryzowania łańcucha fotosyntetycznego transportu elektronów, przyczyniło się
zastosowanie szeregu inhibitorów np. Tris-HCl w wysokich stężeniach ( >0,8 M; >pH 8,3), kwasów
tłuszczowych, hydroksyloaminy, herbicydów, aminotriazyn, 1,10-fenantroliny, DBMIB
(2,5-dibromo-3-metylo-6-izopropylo-p-benzochinonu), chlorku rtęciowego, cyjanku, DSIP-SA (kwasu di-
salicyloino-denopropanodiamino-1,2- disulfonowego).
22
Materiały i odczynniki
1. Rwieżo otrzymane lub rozmrożone chloroplasty ze szpinaku lub grochu o stężeniu chlorofilu 4-6 mg/ml
2. Mieszanina podstawowa do pomiarów aktywnoSci PS II i całego łańcucha fotosyntetycznego zawierająca:
0.8 M sacharozę, 40 mM Tris, 40 mM NaCl, 10 mM MgCl2. Mieszaninę przygotować przez zmieszanie
stężonych roztworów wyjSciowych i po doprowadzeniu pH roztworem HCl do wartoSci 7,6 uzupełnić
wodą dejonizowaną do żądanej objętoSci. Przygotować 50 ml mieszaniny.
3. 50 mM alkoholowy roztwór fenylo-p-benzochinonu, akceptora elektronów z II układu fotosyntezy
(odczynnik przygotowany).
4. Mieszanina reakcyjna do pomiarów aktywnoSci PSII. Należy ją przygotować, tuż przed pomiarem,
poprzez 2-krotne rozcieńczenie mieszaniny podstawowej i 125-krotne rozcieńczenie roztworu fenylo-p-
benzochinonu. Aby rozpuszczony w alkoholu związek nie wytrącił się w czasie dodawania do roztwóru
wodnego, należy roztwór akceptora dodawać małymi kroplami, cały czas mieszając roztwór wodny.
5. 1 mM wodny roztwór metylowiologenu, akceptora elektronów z I układu fotosyntezy. Uwaga -
metylowiologen jest Smiertelną trucizną.
6. Mieszanina reakcyjna do pomiarów aktywnoSci całego łańcucha fotosyntetycznego. Należy ją
przygotować, tuż przed pomiarem, poprzez 2-krotne rozcieńczenie mieszaniny podstawowej (2) i 7.5-
krotne rozcieńczenie roztworu metylowiologenu.
7. Mieszanina reakcyjna do pomiarów aktywnoSci PSI o pH 8,0 zawierająca: 50 mM Tris, 16 mM
askorbinian sodu, 66 M TMPD (N,N,N,N-tetrametylo-p-fenylodiamina), 133 M MV (metylowiologen)
(przygotowana).
8. Etanolowy roztwór kwasu linolenowego o stężeniu 10 mg/ml (przygotowany).
9. 0,025 mM roztwór DCMU (przygotowany).
10. 5,0 mM etanolowy roztwór DBMIB (przygotowany).
11. 8 mM etanolowy roztwór DCMU (przygotowany).
12. 0,96 M roztwór metyloaminy (przygotowany).
Materiały pomocnicze i aparatura
Łaxnia lodowa, pipety automatyczne, elektroda Clarka umieszczona w termostatyzowanym naczynku z
urządzeniami towarzyszącymi i rejestratorem, xródło Swiatła o natężenie 900 moli m-2s-2, pH-metr.
Wykonanie pomiarów
CzynnoSci przygotowawcze. Ustawić temperaturę termostatu na 25oC lub wykonywać pomiar w stabilnej
temperaturze pokojowej. Uruchomić urzadzenia towarzyszące. Umyć dokładnie, posługując się pompką wodną,
naczynko elektrodowe (wodą destylowaną i etanolem). Ustalić szybkoSć mieszania roztworu w naczynku
elektrodowym tak, aby nie tworzyły się pęcherzyki powietrza. Należy wykalibrować układ pomiarowy, w tym
celu do naczynka elektrodowego odmierzyć odpowiednią objętoSć napowietrzonej w temperaturze 25oC
mieszaniny reakcyjnej uzyskaną wartoSć uznając za 100% nasyceniu mieszaniny tlenem. Po usunięciu z
naczynka mieszaniny zawierajęcej tlen, odmierzyć do naczynka odpowiednią objętoSć mieszaniny reakcyjnej
nasyconej azotem w temperaturze 25oC. Otrzymaną wartoSć uznać za odpowiadającą zerowemu nasyceniu
mieszaniny reakcyjnej tlenem. Należy zanotować wartoSci odpowiadające szerokoSć skali pomiarowej.
Pomiary wydzielania i pochłaniania tlenu przeprowadzić wykorzystując komputerowy układ rejestracji danych,
złożony z karty analogowo-numerycznej i odpowiedniego programu. Ustalenie maksymalnego i minimalnego
stężenia tlenu oraz zasad obliczania wartoSci szybkoSci pochłaniania czy wydzielania tlenu należy wykonać
korzystając z porad prowadzącego.
23
Pomiary wydzielania tlenu
Oznaczenie aktywnoSci PSII. Do naczynka z mieszaniną reakcyjną (4) nasyconą azotem dodać w ciemnoSci taką
iloSć chloroplastów aby otrzymać prostoliniowy przebieg reakcji wydzielania tlenu. JeSli jest inaczej powtórzyć
oznaczenie odpowiednio zwiększając lub zmniejszając iloSć dodawanego preparatu.Stężenie chloroplastów w
naczynku elektrodowym powinno wynosić około10 g Chl/ml mieszaniny. Przeprowadzić dalsze oznaczenia,
dodając w po 1-2 minucie oSwietlania:
1. Kolejno porcje po 1-5 l 0,025 mM DCMU
2. 10-15 l kwasu linolenowego o stężeniu 10 mg/ml.
Pomiary pobierania tlenu.
Oznaczenie aktywnoSci całego łańcucha fotosyntetycznego. Do naczynka pomiarowego dodać natlenowaną
mieszaninę reakcyjną (6). Po ustabilizowaniu się układu pomiarowego, dodać do naczynka w ciemnoSci preparat
chlorolastów w iloSci takiej samej lub 2-krotnie mniejszej niż w czasie pomiarów aktywnoSci PSII. Włączyć
xródło Swiatła. Przeprowadzić oznaczenia, dodając w kolejnych próbach po 1-2 minucie oSwietlania:
1. taką iloSć 0.98 M metyloaminy, aby jej stężenie końcowe wyniosło 3 mM (jeSli do oznaczeń stosuje się
o
chloroplasty uprzednio zamrożone i przechowywane w - 80 C, pominąć to oznaczenie). Reakcje
przeprowadzać do momentu wyczerpania się tlenu w naczynku elektrodowym.
2. 1-5 l 5,0 mM DBMIB.
Oznaczenie aktywnoSci PSI. Do umytego wodą i etanolem naczynka elektrodowego odpipetować dwukrotnie
rozcieńczoną mieszaninę reakcyjną (7) i 3 l 8 mM DCMU. Dodać zawiesinę chloroplastów w iloSci ustalonej
poprzednio i po ustabilizowaniu się układu włączyć xródło Swiatła. Reakcję przeprowadzić do momentu
wyczerpania się tlenu.
D. Opracowanie wyników
Otrzymane dane pomiarowe w formacie ASCII zaimportować do arkusza kalkulacyjnego. Opracować wykresy
przedstawiające zmiany napięcia (mV) w funkcji czasu. Na podstawie prostoliniowych przebiegów zmian
napięcia elektrodowego obliczyć szybkoSć reakcji pochłaniania lub wydzielania O2 w mV/min, a następnie
przeliczyć szybkoSć reakcji na iloSć moli O2/min. Do obliczeń potrzebna jest znajomoSć skali pomiarowej (0%
i 100% stężenia tlenu) oraz informacja, że w temperaturze 25oC stężenie tlenu w mieszaninie reakcyjnej wynosi
0,25 mM.
AktywnoSć PSII wyrazić w molach O2 wydzielonego na godzinę na mg chlorofilu. Obliczyć stymulację
aktywnoSci przez związek rozprzęgający. WykreSlić krzywą hamowania wydzielania tlenu przez DCMU
odkładając na osi odciętych stężenie DCMU w mieszaninie reakcyjnej, a na osi rzędnych szybkoSć wydzielania
tlenu (można ją wyrazić w % kontroli). Wyznaczyć przez interpolację stężenie inhibitora, przy którym
obserwuje się hamowanie reakcji w 50%. Obliczyć, w jakim stopniu reakcja jest hamowana przez kwas
tłuszczowy, a w jakim przez DBMIB. AktywnoSć PSI wyrazić w molach O2 pobranego na godzinę na mg
chlorofilu.
Wyniki zestawić w tabeli.
24
ZASTOSOWANIE IMMOBILIZACJI ENZYMÓW W BIOTECHNOLOGII.
OZNACZENIE AKTYWNORCI IMMOBILIZOWANEJ INWERTAZY
Immobilizacja enzymów. Immobilizację można okreSlić jako technikę, która znacznie ogranicza swobodną
dyfuzję cząstek enzymu lub komórek. Metody immmoblizacji enzymów mają zastosowanie w biochemii,
biotechnologii, mikrobiologii, inżynierii chemicznej, głównie ze względu na możliwoSć ich wykorzystania
technologicznego i handlowego. Enzymy można immobilizować metodami chemicznymi, np. kowalencyjnie
wiążąc z noSnikami rozpuszczalnymi lub nierozpuszczalnymi w wodzie, lub metodami fizycznymi, np. poprzez
adsorpcję na nierozpuszczalnych noSnikach, inkluzję w sieci polimerowej czy mikrokapsułkowanie wewnątrz
półprzepuszczalnych membran. Stosowana procedura nie powinna wpływać na aktywnoSć biologiczną enzymu.
Od rodzaju matrycy i sposobu wiązania zależy iloSć, aktywnoSć, stabilnoSć, optimum pH i temperatury działania
immobilizowanego enzymu.
Przykładem immobilizacji jest wykorzystanie jako złoża kwasu alginowego do inkluzji inwertazy, enzymu
hydrolizującej sacharozę. Alginian jest to polisacharyd zbudowany z reszt kwasów D-mannuronowego (M) i
L-guluronowego (G) połączonych wiązaniami 1,4. Występują w nim bloki składające się z M, z G oraz
mieszane: (M M)x (G G)y (M G)z
Kwas alginowy
Alginian otrzymuje się z wodorostów lub niektórych szczepów bakteryjnych. Ma masę cząsteczkową około
250 000, jest nierozgałęziony, długołańuchowy. Rozpuszczony w wodzie daje lepkie roztwory, które można
sterylizować (20 min w temp. 121C). Cechą charakterystyczną alginianu jest jego pęcznienie, a z jonami metali
dwu- i trójwartoSciowych (np. Ca2+, Zn2+, Mn2+, Sr2+, Ba2+, Al3+, Fe3+, lecz nie z Mg2+) tworzenie żeli. Żel
alginianowy jest doSć stabilny, obojętny chemicznie i ma strukturę mikroporowatą. W czasie immobilizacji
enzymów w żelu alginianowym nie obserwuje się istotnej denaturacji enzymu, ponieważ nie towarzyszą temu
procesowi zmiany temperatury i pH.
Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywnoSci immobilizowanej inwertazy (-fruktofuranozydazy, EC 3.2.1.26)
oraz okreSlenie wydajnoSci zamkniętego, cyklicznego reaktora, w którym zachodzi reakcja hydrolizy sacharozy.
Odczynniki
1. 66 mM pirofosforan sodu (pH 8,5) (50 ml)
2. Alginian sodowy (1,5% zawiesina) (10 ml)
3. 0,1 M CaCl2 (50 ml)
4. 0,6 M roztwór sacharozy (30 ml)
5. 2% kwas 3,5-dinitrosalicylowy (DNS) w 0,4 M NaOH (50 ml)
6. 0,05 M bufor octanowy (pH 4,7) (20 ml)
7. Roztwór wzorcowy glukozy (2 mg/ml) (10 ml)
25
Materiały pomocnicze i aparatura
Kolumna (strzykawka) ok. 1 3 ml, termostatyzowany zbiornik 100 150 ml, pompa perystaltyczna przepływ
od 1 do 6 ml/min (zależnie od przekroju rurki), mieszadło magnetyczne, termostat 37C.
Wykonanie
A. Ekstrakcja inwertazy z drożdży piekarniczych
10 g suchych (lub 30 g Swieżych) drożdży piekarskich zawiesić w 30 ml 66 mM pirofosforanu sodu (pH 8,5)
i pozostawić na noc w 20C (lub termostacie w 37C). Odwirować przy 5000 x g przez 20 min. Otrzymany
supernatant, zawierający m.in. inwertazę, przechowywać zamrożony w 20C.
Studenci otrzymują przygotowany ekstrakt z drożdży piekarniczych
B. Immobilizacja inwertazy
Ekstrakt inwertazy (2 ml) miesza się z 10 ml 1,5% zawiesiny alginianu sodu. Następnie zawiesinę
alginian-enzym pipetą dodaje się kroplami do roztworu 0,1 M CaCl2. Powstające granulki immobilizowanego
enzymu o Srednicy od 0,1 4 mm pozostawia się na 20 min w roztworze CaCl2 w celu ich stwardnienia.
Następnie zlewa się roztwór CaCl2, a otrzymane granulki immobilizowanego enzymu przepłukuje wodą
destylowaną i formuje z nich złoże kolumny reaktora.
C. Budowa zamkniętego, cyklicznego układu reaktora
Układ reaktora składa się z trzech częSci: kolumny reaktora (KR), zbiornika (Z) i pompy perystaltycznej (P).
Kolumna reaktora ma objętoSć 1 3 ml, a zbiornik 45 ml. SzybkoSć przepływu, rzędu 1 5 ml min 1, zależy od
przekroju rurki i wydajnoSci pompy.
Kolumną reaktora może być np. strzykawka, zamknięta zwitkiem waty szklanej. Wypływ z kolumny łączy się
elastyczną rurką ze zbiornikiem. Bufor zawierający sacharozę jest podawany ze zbiornika na kolumnę za
pomocą pompy perystaltycznej (P). Kolumnę wypełnia się małymi ziarnami immobilizowanego enzymu.
Wewnętrzny przekrój rurki łączącej kolumnę ze zbiornikiem powinien być mały, by zawierał niewielką objętoSć
roztworu.
ZawartoSć termostatyzowanego zbiornika (37C) powinna być mieszana. Kolumna reaktora może być
termostatowana, co przyspiesza reakcję, ale nie jest to konieczne, jeżeli szybkoSć przepływu ogrzanego roztworu
jest na tyle szybka, aby zapobiec jego schłodzeniu.
Budowa zamkniętego, cyklicznego układu reaktora
26
D. Sporządzanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących
Krzywą wzorcową przygotowuje się, dodając do odpowiednio ponumerowanych probówek 0,1 ; 0,2; 0,3; 0,4;
0,6; 0,8 ml roztworu wzorcowego glukozy o stężeniu 2 mg/ml. Próby uzupełnia się wodą do objętoSci 2 ml i
dodaje 0,2 ml odczynnika DNS. Próbę odniesienia przygotowuje się dodając 0,2 ml odczynnika DNS do 2 ml
wody. Następnie próby po wymieszaniu umieszcza się na 15 min we wrzącej łaxni wodnej, po czym chłodzi i
mierzy ich absorpcję przy 540 nm. Krzywą wzorcową sporządza się, odkładając na osi 0X iloSć glukozy w
poszczególnych próbach, a na osi 0Y odpowiadającą im wartoSć absorbancji, a następnie wykreSlając
przechodzącą przez punkt (X:Y) = 0, prostą regresji dla wyznaczonych punktów. Na podstawie pomiarów
absorbancji dla wzorcowych roztworów glukozy (C6H12O6, Mcz = 180,16 g mol 1) wykreSlić krzywą wzorcową.
E. Hydroliza roztworu sacharozy
Zbiornik napełnia się 20 ml roztworu sacharozy (0,6 M) i 10 ml 0,05 M buforu octanowego (pH 4,7). Od
momentu włączenia mieszadła i pompy liczy się czas 0. Kontrolę przebiegu hydrolizy sacharozy przeprowadza
się przez 80 100 minut, pobierając do ponumerowanych probówek co 10 minut okreSlone objętoSci roztworu
(50 300 l) do oznaczania powstających cukrów redukujących. Należy pamiętać o pobraniu próby w czasie 0.
Następnie połowę objętoSci pobranej próby należy przenieSć do nowej probówki i uzupełnić wodą do 2 ml,
dodać 0,2 ml roztworu DNS i wstawić do wrzącej łaxni wodnej na 15 min. Następnie zchłodzić, wymieszać i
zmierzyć absorbancję przy 540 nm. W ten sposób Sledzi się przebieg hydrolizy sacharozy w ciągu godziny.
SzybkoSć tej reakcji zależy od aktywnoSci immobilizowanego enzymu i jego kontaktu z substratem.
F. Opracowanie wyników, krzywa hydrolizy sacharozy
Z krzywej wzorcowej wyznaczyć zawartoSć cukrów redukujących (w molach) w poszczególnych próbkach
pobranych w czasie trwania reakcji. Z tych wartoSci wyliczyć całkowite stężenia (mM) sacharozy (C12H22O11,
Mcz = 342,3 g mol 1) w zbiorniku w kolejnych czasach (St), pamiętając, że z jednej cząsteczki sacharozy
powstaje cząsteczka glukozy i cząsteczka fruktozy. Znając początkowe stężenie sacharozy (S0), wykreSlić
krzywą konwersji: f(t) = (S0 St)/S0, informującą o wydajnoSci reaktora.
Krzywa konwersji (przykład)
27
ANALIZA ELEKTROFORETYCZNA PRODUKTÓW TRAWIENIA
HISTONU H1 PAPAINĄ
Papaina (EC 3.4.22.2) jest enzymem proteolitycznym z mleczu roSliny tropikalnej Carica papaya. Jest to
zasadowe białko, składające się z jednego łańcucha peptydowego zawierającego 4 mostki dwusiarczkowe i
istotną dla funkcji katalitycznej cysteinę. Do osiągnięcia pełni aktywnoSci enzymatycznej papaina musi mieć
wolną grupę -SH i lekko kwaSne Srodowisko. Czynniki blokujące grupy tiolowe, jak np. kwas jodooctowy, są
silnymi inhibitorami papainy natomiast związki tiolowe, jak merkaptoetanol, jej aktywatorami. Papaina jest
enzymem o względnie małej specyficznoSci, na którą składają się: aktywnoSć endopeptydazy, esterazy i
amidazy. Z uwagi na budowę centrum aktywnego papaina wykazuje jednak preferencje do pewnych sekwencji
aminokwasów. Centrum aktywne papainy składa się z 7 miejsc, z których każde wiąże jedną resztę
aminokwasową substratu.
H2N-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-COOH
hydroliza
Miejsce R3 wykazuje szczególne powinowactwo do fenyloalaniny. Dlatego obecnoSć Phe w pozycji 3 lub dalej
od C-końca zwiększa podatnoSć polipeptydu na hydrolizę, natomiast peptydy zawierające Phe w pozycji 2, np
Ala-Ala-Phe-Ala, są inhibitorami papainy.
W ćwiczeniu substratem papainy jest histon H1 występujący w postaci dwóch wariantów sekwencyjnych o
masie cząsteczkowej 21000 i 22000. Cząsteczka histonu H1 składa się z trzech domen: fragmentu Srodkowego
o długoSci 80 aminokwasów, który tworzy stabilną, oporną na działanie proteaz, strukturę globularną w
stężonych roztworach soli, oraz dwóch luxnych, niesfałdowanych końców.
Materiały i odczynniki
1. 30% akrylamid, 0,8% bisakrylamid. 30 g akrylamidu i 0,8 g bisakrylamidu rozpuScić w około 50 ml wody
destylowanej. Uzupełnić objętoSć do 100 ml i mieszać przez 0,5 godz. z 10 g wymieniacza jonowego.
Przesączyć przez bibułę i przechowywać w ciemnej butelce. Uwaga! akrylamid jest groxną trucizną
(odczynnik przygotowany).
2. 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (potrzeba 50 ml buforu).
3. 0,625 M Tris-HCl, pH 6,8 (potrzeba 25 ml buforu).
4. 1% SDS (odczynnik przygotowany).
5. 10% nadsiarczan amonowy. BezpoSrednio przed użyciem rozpuScić 30 mg nadsiarczanu w 300 l wody
destylowanej. Przechowywać w lodzie.
6. TEMED. Przechowywać w lodówce (odczynnik firmowy).
7. 5-ciokrotnie stężony bufor elektrodowy Tris-glicyna, pH 8,3 (0,125 M Tris, 0,96 M glicyna) zawierający
0,5% SDS (odczynnik przygotowany). Przed użyciem rozcieńczyć wodą dejonizowaną! Przygotować 0,8 l
buforu.
8. 1M Tris-HCl, pH 6,8 (potrzeba 25 ml buforu).
9. Mieszanina do denaturacji białka o składzie: 20% glicerol, 0,2% błękit bromofenolowy, 4% SDS, 20%
merkaptoetanol (odczynnik przygotowany).
10. 5 M NaCl. Przygotować 10 ml roztworu.
11. Roztwór soli rtęci (Hg) 2mg/ml (odczynnik przygotowany).
12. 5% merkaptoetanol (MET) (odczynnik przygotowany).
28
13. Roztwór papainy 0,2 mg/ml. Odważyć bardzo dokładnie naważkę na 10 lub 20 ml. RozpuScić w oziębionej
wodzie dejonozowanej tuż przed użyciem. Przechowywać w lodzie.
14. Roztwór Histonu H1 (4mg/ml) (przygotowany).
15. Roztwór barwiący. 1 g Coomassie Blue R-250 rozpuScić w 1000 ml mieszaniny 25% alkoholu
izopropylowego i 10% kwasu octowego (odczynnik przygotowany).
16. Roztwór odbarwiający. 100 ml izopropanolu zmieszać ze 100 ml kwasu octowego i uzupełnić wodą
destylowaną do objętoSci 1 l.
17. n-Butanol (odczynnik gotowy).
Materiały pomocnicze i aparatura
Forma do żelu (2 płytki szklane, listewki plastikowe, "grzebień", zaciskacze 6 szt.), smar, pipety serologiczne,
pipety automatyczne, nasadka na pipety, aparat do elektroforezy, zasilacz prądu stałego, termostat (37oC),
rękawiczki chirurgiczne, szpatułki plastikowe, mikrowirówka, mikromieszadło, wentylator, probówki plastikowe
typu Eppendorfa 20 szt, kuweta porcelanowa.
Wykonanie
Uwaga!
Niespolimeryzowany akrylamid jest silną neurotoksyną. Wszystkie czynnoSci związane z przygotowaniem żelu
wykonać na arkuszu bibuły, pod opieką asystenta. Używać rękawiczek i nasadki na pipety.
A. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego
Dwie czyste, odtłuszczone metanolem, suche płytki szklane (jedna pełna, druga z wycięciem) złożyć równo,
wkładając między nie plastikowe listewki nasmarowane smarem silikonowym tak, aby po dociSnięciu
zaciskaczami utworzyły szczelną formę. Tak przygotowaną formę ustawić pionowo.
Przygotować roztwory monomerów wg tabeli:
Odczynnik 6% żel zatężający 15% żel rozdzielający
30% akrylamid 0,8% bis 2 ml 15 ml
1% SDS 1 ml 3 ml
0,625 M Tris-HCl pH 6,8 2 ml --------
1,5 M Tris-HCl pH 8,8 -------- 7,5 ml
Woda dejonizowana 5 ml 4,5 ml
ObjętoSć całkowita 10 ml 30 ml
Roztwory dokładnie wymieszać i oziębić w łaxni lodowej. Z roztworu 15% pobrać do osobnej zlewki 5 ml,
dodać najpierw 20 l TEMED, a następnie 100 l roztworu nadsiarczanu amonu, zamieszać. Z przygotowanego
roztworu utworzyć "stopkę" uszczelniającą formę od dołu. Po ok. 20 min, kiedy żel stężeje, do pozostałej
częSci 15% roztworu dodać 20 l TEMED i 100 l roztworu nadsiarczanu amonu (należy zachować kolejnoSć
dodawania roztworów). Po zamieszaniu, wylać roztwór między szyby formy, tak aby górna granica płynu
znajdowała się w odległoSci około 2.5 cm od górnej, wyciętej krawędzi szyby. Na wierzch roztworu nanieSć 0,5
ml butanolu i pozostawić około godziny do czasu spolimeryzowania żelu.
Po zakończeniu polimeryzacji, co sygnalizuje powstanie wyraxnej granicy faz między butanolem a wypchniętą
z żelu wodą, zlać butanol a wolną przestrzeń między szybami przepłukać dokładnie wodą destylowaną i
starannie osuszyć bibułą. Zamontować "grzebień" i wlać w wolną przestrzeń, za pomocą pipety, 6% roztwór
monomerów po uprzednim dodaniu 20 l TEMED i 50 l nadsiarczanu amonu. Po około 30 minutach, kiedy
29
żel spolimeryzuje, zdjąć zaciskacze i szczelnie owinąć formę folią aluminiową. Żel przechowywać w lodówce
(nie zamrażać).
B. Trawienie histonu H1 papainą
Z roztworu HgCl2 o stężeniu 2 mg/ml sporządzić, poprzez kolejne rozcieńczenia, po 1 ml roztworów Hg+ o
stężeniach 10-1, 10-2 i 10-3 w odniesieniu do roztworu wyjSciowego. W probówce Eppendorfa wymieszać 200 l
roztworu histonu H1 z 200 l 1 M Tris-HCl (pH 6,8). Następnie dodać po 30 l rozcieńczonego roztwóru
histonu do 12 ponumerowanych probówek Eppendorfa.
Pozostałe odczynniki (w l) dodać według schematu:
Numer próby 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
5% MET --- --- --- --- --- --- 10 --- --- --- --- ---
5 M NaCl --- --- --- --- --- --- --- 10 --- --- --- ---
Hg+ --- --- --- --- --- --- --- --- 10 10 10
10
Stężenie
wyjSciowe 2 0,02 0,002
0,2
mg/ml
H2O 20 20 --- 10 15 18 8 --- --- --- --- ---
Papaina* --- --- 20 10 5 2 2 10 10 10 10 10
*
Roztwór papainy o stężeniu 0,2 mg/ml sporządzić dopiero po odpipetowaniu wszystkich pozostałych roztworów i dokładnym ich
wymieszaniu. Roztwór papainy przechowywać w lodzie.
Roztwór papainy należy dodać jako ostatni i próby natychmiast wymieszać. Po odwirowaniu przez 5 sekund
w mikrowirówce inkubować przez 20 minut w temperaturze 37oC. Niezwłocznie po zakończeniu inkubacji do
każdej probówki dodać po 50 l roztworu do denaturacji, wymieszać zawartoSć i wstawić probówki do gotującej
się wody na 1-2 minut. Po ostudzeniu próby odwirować przez 5 sekund w mikrowirówce. Próby można
przechować zamrożone w temp. -10oC.
C. Elektroforeza
Ostrożnie wyjąć "grzebień" z formy do żelu, następnie przy pomocy zaciskaczy zainstalować formę w aparacie
do elektroforezy, tak aby jej tylna szyba (wycięta) przylegała do Scianki. Nalać rozcieńczonego buforu
elektrodowego do górnego naczynia aparatu, tak aby "studzienki" powstałe po wyjęciu "grzebienia" były
całkowicie zalane buforem i przepłukać je przy pomocy 1 ml pipety automatycznej. Nalać buforu do dolnego
naczynia, następnie połączyć elektrody aparatu z zasilaczem prądu stałego: górną z (-) a dolną z (+) (bardzo
ważne, nie pomylić się).
Pierwszą i ostatnią "studzienkę" zostawić niewypełnioną, a do pozostałych 12 wprowadzić ostrożnie, za
pomocą pipety automatycznej, po około 40 l zdenaturowanych roztworów białka, zwracając uwagę na
kolejnoSć nanoszonych prób. Włączyć wentylator i skierować strumień powietrza na aparat do elektroforezy.
Włączyć zasilacz prądu stałego nastawiwszy uprzednio napięcie na 0 V (0 mA). Doprowadzić natężenie prądu
do wartoSci 10 mA. Natężenie prądu należy utrzymać na stałym poziomie 10-20 mA przez cały czas trwania
elektroforezy. Elektroforezę przerwać po około 4 godzinach, gdy barwnik dojdzie do końca płytki. Doprowadzić
napięcie do 0 V (0 mA), wyłączyć zasilacz i odłączyć przewody łączące zasilacz z aparatem do elektroforezy.
30
D. Barwienie żelu
Znanych jest wiele metod barwienia żeli elektroforetycznych. Przedstawiona poniżej metoda (patrz
odczynniki) nie wymaga stosowania utrwalania żelu poliakrylamidowego przed zabarwieniem roztworem
barwnika.
Po wylaniu buforu z aparatu zdjąć zaciskacze i ostrożnie, pod nadzorem asystenta, wyjąć żel z formy. Żel
zagęszczający odciąć a rozdzielający przenieSć do kuwety porcelanowej i zalać roztworem barwnika (Coomassie
R-250). Roztwór barwnika z żelem pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc, nie dopuszczając do
przywarcia żelu do dna naczynia. Następnie zlać barwnik z powrotem do butelki, a żel przemywać kolejnymi
porcjami odbarwiacza aż do momentu ukazania się wyraxnych prążków białka. Zużyty odbarwiacz zlewać do
osobnej zlewki. Żel przechowywać w roztworze 50% metanolu lub etanolu (ulega wtedy częSciowemu
odwodnieniu).
E. Opracowanie wyników
Wybarwiony żel należy pozostawić przez dwie doby w 50% metanolu, nastepnie można zeskanować w celu
dokumentacji doswiadczenia.
Na podstawie własnego elektroforogramu opisać efekty trawienia histonu H1 papainą w różnych warunkach
i wytłumaczyć istniejące różnice.
Elektroforetyczny rozdział produktów trawienia histonu H1 papainą. Próby naniesiono na żel w
kolejnoSci podanej w tabeli
31
Literatura
Zagadnienia podstawowe, metody badań i obliczeń biochemicznych.
Stryer L., Biochemia. PWN, Warszawa 2005
Zgirski A., Gondko R., Obliczenia biochemiczne, PWN, Warszawa 1998 i wydania póxniejsze.
Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), Ćwiczenia z biochemii, PWN, Warszawa 1980 i wydania póxniejsze.
Nicholls D.G., Ferguson S.J. Bioenergetyka 2. PWN, Warszawa 1995.
D. Hall, K. Rao, Fotosynteza, WNT, Warszawa 1999
Cornish-Bowden A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. Buttrrworths, London 1995
strona WWW Cornish-Bowdena: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mcainfo.htm
Witwicki J., Ardelt W. (red), Elementy enzymologii, PWN, Warszawa 1984.
dowolny podręcznik chemii fizycznej, np. Pigoń K., Ruziewicz Z. Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa
Strona główna NC-IUBMB, nomenklatura enzymów: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
Baza enzymatyczna Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
Baza enzymatyczna Expasy: http://www.expasy.ch
Strona główna programu Gepasi: http://www.gepasi.org/
Strona główna programu Copasi: http://www.copasi.org/tiki-index.php
Wymagania (należy zwrócić szczególną uwagę na praktyczną stronę wykonywanych ćwiczeń oraz na
związek założeń teoretycznych ze sposobem zaplanowania i wykonania konkretnych doSwiadczeń).
Kinetyka chemiczna. Kinetyka enzymatyczna - hiperboliczna z jednym substratem, z wieloma substratami.
Kinetyka niehiperboliczna. Enzymy regulatorowe, allosteria. Kinetyka hamowania reakcji enzymatycznych.
Metody badania aktywnoSci enzymów. Jednostki enzymatyczne. Budowa białka enzymatycznego (struktura
molekularna enzymu). Oddziaływania między enzymem a substratem. Energetyka reakcji enzymatycznych.
Mechanizm reakcji enzymatycznych. Podział enzymów. Kofaktory. Przykładowe szlaki metaboliczne.
Metody izolowania białek enzymatycznych. Oczyszczanie enzymów. Bilans oczyszczania. Charakterystyka
oczyszczonych enzymów. Wykorzystanie metod elektroforetycznych i spektrofotometrycznych w badaniach
enzymów i kompleksów błonowych.
Błonowe kompleksy enzymatyczne biorące udział w procesach bioenergetycznych. Budowa kompleksów
fotosyntetycznych i mitochondrialnych. Procesy biochemiczne wykorzystujące elektrochemiczny potencjał
jonowy. Komórkowe procesy utlenienia i redukcji. Termodynamika a procesy bioenergetyczne. Izolowanie
struktur komórkowych. Metody badania fotosyntezy i oddychania mitochondrialnego.
32
Enzymologia II" - wykonanie i zaliczanie ćwiczeń.
1. Rozpoczynając ćwiczenia należy zaplanować bieżącą pracę na podstawie informacji zawartych w
przepisach do ćwiczeń. W przypadkach wątpliwoSci należy niezwłocznie skorzystać z pomocy
prowadzących.
Warunkiem rozpoczęcia zajęć jest dostarczenie prowadzącemu planu pracy na dany dzień
ćwiczeń.
2. Szkło potrzebne do wykonania ćwiczeń znajduje się w szafkach studenckich. Dodatkowy drobny
sprzęt wydawany jest przez prowadzących.
3. Niektóre odczynniki (oznaczone w tekScie jako "przygotowane") są przygotowane i wydawane
przez prowadzących. Pozostałe odczynniki należy przygotować samodzielnie.
4. Student ma obowiązek prowadzić dziennik laboratoryjny oraz wypełniać na bieżąco
arkusze sprawozdań, do których wpisuje wyniki, obliczenia rachunkowe, uwagi i wnioski
dotyczące wykonywanego ćwiczenia oraz opracowanie wyników.
5. Zaliczenie ćwiczeń odbywa się na podstawie:
a) poprawnego wykonania ćwiczeń i opracowania wyników
b) zdania przewidzianych sprawdzianów
6. Student może wykonywać jednoczeSnie jedynie dwa ćwiczenia. Wydanie kolejnego ćwiczenia
może nastąpić po zaliczeniu jednego z dwóch poprzednio wykonanych.
33
Regulamin pracy w laboratorium.
1. Podczas pracy w laboratorium konieczny jest fartuch i odpowiednie obuwie.
2. W pracowni nie wolno jeSć ani palić.
3. Ubranie wierzchnie należy pozostawić w szatni, natomiast torby, teczki itp. składać w miejscu do tego
przeznaczonym.
4. Każdy student jest odpowiedzialny za utrzymanie porządku w pracowni. Nie utrudniaj pracy sobie,
kolegom i prowadzącym.
5. Należy specjalnie dbać o aparaturę. Przed przystąpieniem do pracy należy zapoznać się z jej obsługą. Po
zakończeniu pracy należy pozostawić aparat w takim stanie, aby mógł być bez przeszkód użyty przez
następną osobę.
6. Z rozpuszczalnikami organicznymi niskowrzącymi można pracować wyłącznie w pomieszczeniach
przystosowanych do tego celu.
7. Alkohol używany w laboratoriach skażony jest w dawkach niebezpiecznych dla zdrowia.
8. Stężone kwasy, zasady i inne substancje żrące używać w wyznaczonych miejscach. Rozlane żrące płyny
należy natychmiast wytrzeć. Skórę oparzoną kwasem lub zasadą należy spłukać dokładnie bieżącą
wodą, następnie przemyć 5% roztworem NaHCO3 (kwas) lub 2% CH3COOH (zasada).
9. Mając do czynienia z silnie trującymi związkami należy zachować szczególną czystoSć rąk i miejsca
pracy. Do pipetowania trucizm używać specjalnych gruszek lub nasadek na pipety.
10. O każdym, nawet drobnym wypadku należy natychmiast powiadomić prowadzącego ćwiczenia.
34
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Materialy do cwiczenia 8Ćw Materiały do ćwiczeń z elektrotechnikiPG materiały do ćwiczeń testyBAL materiały do ćwiczeńMateriały do cwiczenia nr 11Fwd materialy?ukacyjne do cwiczen z rachunkowosci ?zNazwy1Materiały do ćwiczeń z geologii te co umiećMateriały do cwiczenia 11Materiały do ćwiczeń projektowych cz 1 Wodociągimaterial do cwiczenmaterial do cwiczen1MATERIALY DO CWICZENIA BIOLOGIA CYTOMETRmaterial do cwiczen 3CHROMATOGRAFIA JONOWA materialy do cwiczenMikroekonomia materiały do ćwiczeńwięcej podobnych podstron