ZAGADNIENIA DO KOLOKWIUM 2 Z BIOCHEMII
1. Struktura II rzędowa DNA:
Struktura I-rzędowa to kolejność zasad azotowych, a II-rzędowa to podwójna helisa.
Prawoskrętna helisa typu B złożona z dwóch biegnących antyrównolegle i
komplementarnych względem siebie nici. Struktura ta jest stabilizowana wiązaniami
wodorowymi [A=T oraz Ca"G], a jej forma wynika z hydrofobowości zasad azotowych
wewnątrz helisy oraz hydrofilowości cukrów i reszt fosforanowych na zewnątrz. Występują
też tzw. oddziaływania warstwowe, czyli oddziaływanie ze sobą elektronów Ą [pi] leżących
nad sobą płasko zasad azotowych. Dzięki swojej budowie helisa jest stabilna, rozpuszczalna
w wodzie i giętka [to umożliwia jej upakowanie przez owijanie wokół białek].Średnica
helisy to 2nm, na jeden skręt przypada 10 nukleotydów, występują dwie bruzdy [duża i
mała] rozpoznawane przez enzymy.
2. Struktura ą-heliks białka:
ą-heliks jest to drugorzędowa struktura białkowa (cylindryczna) śruba. Struktura ta jest
stabilizowana wiązaniami wodorowymi występującymi w rdzeniu ą-heliksu pomiędzy
grupami NH i CO oraz oddziaływania Van der Waalsa. Ciasno skręcony łańcuch główny
polipeptydu tworzy rdzeń ą-heliksu, a łańcuchy boczne aminokwasów wystają na zewnątrz
w ułożeniu helikalnym. Może występować prawo i lewo skrętna, ale prawoskrętna jest
energrtycznie uprzywilejowana, gdyż występuje w niej mniej zawad sterychnych pomiędzy
łańcuchami bocznymi a szkieletem (rdzeniem). Na jeden obrót ą-heliksu przypada 3,6 reszt
aminokwasowych, a skok ą-heliksu wynosi 0,54 nm. Zawartość ą-heliksu w białkach jest
bardzo różna i waha się od prawie zerowej do niemal 100%.
3. Struktura III rzędowa białka:
Struktura trzeciorzędowa określa ogólne rozmieszczenie przestrzenne i wzajemne
powiązania skręconych łańcuchów, oraz poszczególnych reszt aminokwasowych w
pojedynczych łańcuchach polipeptydowych, bez uwzględnienia zależności z
poszczególnymi podjednostkami. Opisuje organizację przestrzenną białka na poziomie
wyższym niż struktura drugorzędowa. Strukturę trzeciorzędową stabilizują mostki
disiarczkowe, różne typy wiązań wodorowych, wiązania jonowe, wiązania estrowe,
oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe i oddziaływania Van der Walsa.
Charakteryzuje się dużą zwartością, jest pozbawiona pustych przestrzeni w środku
cząsteczki. Wszystkie boczne grupy obdarzone ładunkiem występują na powierzchni
cząsteczki, aby mogły oddziaływać z wodą. Duże hydrofobowe grupy są przeważnie
schowane do środka cząsteczki. Niekiedy trudno jest zauważyć granicę pomiędzy strukturą
drugorzędowa, a już trzeciorzędową.
4. Rozdzielanie/rozróżnianie/wykrywanie:
DNA od RNA (metody chromatograficzne) - Chromatografia bibułowa, czyli metoda
oparta na różnicy powinowactwa substancji rozdzielanych do fazy stacjonarnej [woda
uwięziona we włóknach celulozy] i fazy ruchomej [odpowiednio dobrana mieszanina
rozwijająca; ważne pH i polarność]. Sączenie molekularne jest także chromatografią
podziałową. Jednak czy można stosować do rozdzielania DNA od RNA? Jest też HPLC RP,
chromatografia jonowymienna [w pH fizjologicznym DNA ma ładujek ujemny, a DNA wiąże
się silniej niż RNA]. (rozdzielanie)
nukleotydy i nukleozydy - Nukleotyd jest estrem nukleozydu i kwasu ortofosforowego.
Tę informację możemy wykorzystać przeprowadzając hydrolizę kwaśną próbki, a następnie
wykrywając obecność kwasu ortofosforowego reakcją barwną po uprzednim rozdzieleniu
składników hydrolizatu za pomocą chromatografii bibułowej. Innym skutkiem obecności
reszty fosforanowej jest zwiększona polarność cząsteczki. (rozróżnienie)
 aminokwasy białkowe od nukleotydów  1) próba z ninhydryną: dzięki obecności
grupy aminowej i karboksylowej alfa-aminokwasy dają w pH>4 w reakcji z ninhydryną
fioletowe zabarwienie (powstaje purpura Ruhemanna). Nukleotydy dają ujemny wynik
próby z ninhydryną. 2) reakcja Biala: po hydrolizie kwasowej nukleotydów powstają
wolne pentozy, a z nich furfural, który daje zielone produty w reakcji z orcyną.
Aminokwasy dają wynik ujemny w reakcji Biala. 3) reakcja Dischego:
deoksyrybonukleotydy w reakcji z difenyloaminą w środowisku kwaśnym i podwyższonej
temperaturze dają niebieskie zabarwienie. Aminokwasy dają wynik ujemny próby.
(rozróżnienie/wykrycie)
białko od kwasu nukleotydowy - 1) Do badanego roztworu nalezy dodać roztwór SDS
(dodecylosiarczan sodu) i następnie przeprowadzić elektroforeze na żelu
poliakryloamidowym. Po zakończniu elektroforezy nalezy dodać bromku etydyny lub DAPI
(są to barwniki fluorescencyjne wybarwiające kwasy nukleinowe) i błękitu Comassiego
(wybarwia białka). Jeżeli po wzbudzeniu światłem pojawią się prążki świecące na
pomoarańczowo (przy bromku etydyny) lub na niebiesko (przy DAPI), to oznacza że w
roztworze znajdowały się kwasy nukleinowe. Jeżeli po wybarwieniu błękitem Comassiego
pojawiły się niebieskie prążki to oznacza, że w roztworze znajdowały się białka. 2) Można
roztwór poddać działaniu niskiego pH (<3,5). Jeżeli wytrąci się osad, oznacza to że w
badanym roztworze znajdują się białka. Można następnie odwirować osad, podzielic
supernatant na dwie próbki i do jednej dodać odczynnika Dischego, a do drugiej odczynnika
Biala. Jezeli po ogrzewaniu w łąz
ni wodnej przez okraślony czas pojawi się barwa zielona w
reakcji Biala lub niebieska w reakcji Dischego, oznacza to że w roztworze znajdowały się
kwasy nukleinowe. W przypadku braku strontu należy równiez poddać roztwór rekacjom
Biala i Dischego tak jak jest to opisane powyżej, dzięki czemu można będzie potwierdzić
obecność kwasów nukleinowych. Jeżeli wytrącił się osad, to po zlaniu supernatantu mozna
dodać kwasu azotowego (V)  jeżeli pojawi sie pomarańczowe/żółte zabarwienie to
oznacza, że w osadzie obecne są białka. (rozróżnienie/wykrycie)
rybonukleotydy od RNA - 1) Na początku należy podzielić badany roztwór na dwie
próbki. Do pierwszej z nich dodać barnika fluorescencyjnego np. bromek etydyny lub DAPI.
Barwnik ten interkaluje pomiędzy pierścienie zasad w kwasach nukleinowych. Następnie po
wzbudzeniu światłem UV jezeli zaobserwujemy świecenie próbki (pomarańczowe/ceglaste
światło dla bromku etydyny lub niebieskie dla DAPI), to oznacza że w roztworze znajduje
się RNA. Aby sprawdzić czy w badanym roztworze znajduja sie nukleotydy, nalezy
najpierw do drugiej próbki dodać 96% etanol i odwirować ewentualny wytrącony osad
(RNA). Następnie należy do supernatantu dodać odczynnika Biala (jeżeli pojawi się zielona
barwa, to oznacza to że w roztworze obecne były rybonukleotydy). Zestawiając wyniki
próby Biala i wybarwiania barnikami fluorescencyjnymi można określić jaki był skład
pierwotnego roztworu.
2) Można badany roztwór poddać dializie, nukleotydy przejdą przez pory w woreczku
dializacyjnym i w ten sposób na zewnątrz woraczke otrzymamy roztwór nukleotydów, a
wewnątrz pozostanie w znacznej większości RNA. Aby potwierdzić obcność
rybonukleotydów w roztworze, nalezy przeprowadzić próbe Biala. Natomiast aby
potwierdzić obecność RNA w woreczku dializacyjnym, nalezy pobrać próbke, przenieść do
probówki i dodać barwnika fluorescencyjnego  DAPI lub bromku etydyny, a następnie
wzbudzić UV, jeżeli zacznie świecić (na pomarańczowo dla bromku, a na niebiesko dla
DAPI) to w roztworze wyjściowym znajdowało się RNA.
5. HPLC  interpretacje chromatografu:
np. chromatografia HPLC w odwróconej fazie - Lys, Glu, Asp. Aminkwasy
przeprowadzone w barwne pochodne przez przyłączenie hydrofobowego chromoforu -
chromatografia jest w odwróconej fazie [Reversed Phase HPLC], więc z kolumny szybciej
wylatują substancjie bardziej polarne. Do reszt karboksylowych przyłączany jest związek,
który zmniejsza polarność aminokwasów: Lys - 1 grupa COOH - do 1 cząsteczki
aminokwasu przyłączona będzie 1 grupa chromoforowa Asp i Glu - 2 grupy COOH - na 1
cząsteczkę aminokwasu przypadają 2 grupy chromoforowe Wynika z tego, że w
najmniejszym stopniu zostanie ograniczona polarność Lys - czyli pozostanie na najbardziej
polarna. Barwnikowa pochodna Asp bedzie bardziej polarna, niż analogiczna pochodna Glu,
ponieważ Glu ma nieznacznie dłuższy łańcuch węglowodorowy.
Prawidłowa kolejność wylotu:
Lys  wychodzi z kolumny jako pierwsza, bo pochodna najbardziej polarna
Asp  w środku; dwie grupy przyłączone, ale łańcuch krótszy od Glu
Glu  ostatni; pochodna najmniej polarna
np. HPLC w odwróconej fazie DABsylowych pochodnych Lys i Met. Pierwszy szczyt
 20 min i pole 10.000, drugi szczyt  30 min i 5.000 - Czas retencji mówi nam o
charakterystyce jakościowej związków, więc ta informacja nie będzie użyteczna do
wnioskowania o ilości. Warto jednak przypomnieć, że reszta DABsylowa przyłącza się do
grupy  NH aminokwasu zmniejszając jego polarność i tym samym zwiększając czas
2
retencji w chromatografii metodą HPLC RP. Lizyna [Lys] posiada jedną dodatkową grupę
aminową, więc jej polarność bardziej obniży się w wyniku DABsylacji. Z tego powodu czas
retencji tej frakcji wzrośnie. O ilości aminokwasów w próbce świadczy powierzchnia pod
szczytem. Im większa powierzchnia tym większe stężenie badanej substancji w próbce. Na
tej podstawie możnaby pochopnie stwierdzić, że w badanej próbce było w przybliżeniu
dwukrotnie więcej metionyny [Met] niż lizyny [Lys]. Jednak czy na pewno? Nie,
ponieważ masa aminokwasów została znacznie zmodyfikowana przy DABsylacji. Lizyna
przyłączyła dwie DABs, a metionina tylko jedną. Dlatego tak naprawdę początkowe
stężenia aminokwasów były z dobrym przybliżeniem równe.
6. GLC  interpretacja wykresów komputerowych i charakterystyka metody:
np. GLC estrów kwasów tluszczowych (C16, C18 i C20). Wyszly 3 szczyty o
podanych czasach retencji. Przeprowadzono druge GLC. Wyszly 2 szczyty o czasach
mniejszych - Przyczyną takiej sytuacji mogła być zwiększona temperatura podczas
drugiego GLC, co spowodowało zwiększenie lotności wszystkich badanych związków
(współczynnik podziału przesunął się w strone fazy ruchomej)  lotność jednego ze
związków zwiększyła się do tego stopnia, że opuścił on kolumnę w niemal takim samym
czasie co rozpuszczalnik, przez co piki się nałożyły na siebie i na chromatogramie widoczne
były tylko dwa piki nie licząc piku rozpuszczalnika. Drugą przyczyną mogła być zbyt
wysoka szybkości przelotu gazu nośnego w drugim GLC, co sprawiło że jeden ze związków
nie miał czasu na oddysocjowanie z fazy stacjonarnej, a więc nie nastąpił jego rozdział.
Trzecią przyczyną mogło być zastosowanie innego gazu nośnego w drugim GLC, który
wszedł w reakcje z jednym z rozdzielanych związków i tym sposobem zafałszował wyniki
rozdziału.
np. na wykresie komputerowym chromatografii gazowej otrzymano jeden szczyt
(poza szczytem rozpuszczalnika). Czy umożliwia to nam stwierdzenie, że rozdzielany
był jeden związek? - Nie możemy stwierdzić że w rozdzielanym roztworze znajdował się
tylko jeden związek, bazujac tylko na tym że na wykresie komputerowym otrzymaliśmy
tylko jeden pik poza pikiem rozpuszczalnika, gdyż: 1) w tym roztworze mogły się
znajdować np. dwa związki o bardzo zbliżonej lotności  właściwości chromatograficznej
(np. izomery); 2) rozpuszczalnik mógł być z
le dobrany w wyniku czego pozostałe
substancje się nie oddzieliły np. rozpuszczalnik miał zbyt wysoką temp. wrzenia
(rozpuszczalnik powinien być niskowrzącą cieczą) ; 3) mogła być zbyt wysoka temperatura,
co sprawia, że związki dużo szybciej odparowywują z rozpuszczalnika (zwieksza się ich
lotność)  temp. tak wysoka, że różnice lotności zostały zniwelowane  wszystkie
substancje odparowały niemal jednocześnie; 4) zbyt duża szybkość przelotu gazu nośnego
(np.azotu)  cząsteczki wszystkich substancji zostały oderwane (cząteczki nie miały czasu
na oddysocjowanie z fazy stacjonarnej)  nie nastąpił rozdział; 5) mógł być z
le dobrany gaz
nośny  mógł wchodzić w reakcje z niektórymi substancjami z roztworu, co zafałszowało
wyniki rozdziału, 6) mogła byc z
le dobrana faza stacjonarna  ciecz o zby niskiej temp.
wrzenia (faza stacjonarna powinna być wysokowrzącą cieczą) . Aby móc z wiekszym
prawdopodobieństwem stwierdzić (choć nadal nie w 100%) czy w próbie był jeden czy
więcej związków, można: 1) pobrać próbkę z wykraplacza par i poddać ją analizie na
spektrografie mas lub spektrometrze w podczerwieni, 2) zmniejszyć temperature, co
spowoduje spadek lotności rozdzielanych substancji i przesunięcie współczynnika podziału
w strone fazy stacjonarnej, 3) zmienić gaz nośny (który mógł wchodzić w reakcje ze
związkami rozdzielanymi) na gaz szlachetny, 4) zmienić faze stacjonarną na wysokowrzącą
ciecz.
np. zmiany czasów retencji dla związków np. o czasie retencji 5min i 20 min, po
zwiększeniu temperatury i zmniejszeniu szybkości przelotu gazu nośnego - 1)
zwiększenie temperatury powoduje przesunięcie współczynnika podziału w stronę fazy
ruchomej (gazu nośnego), co powoduje zwiększenie lotności i zmniejszenie czasu retencji 
związek który miał czas retencji 5 min może nie oddzielić się od rozpuszczalnika, gdyż jego
czas retencji może spaść do 0, natomiast czas retencji drugiego związku zmniejszy się z 20
min do jakiejś mniejszej wartości, w zależności od wielkości zmiany temperatury. 2)
zmniejszenie szybkości przelotu gazu nośnego spowoduje przesunięcie współczynnika
podziału w strone fazy stacjonarnej (wysokowrząca ciecz), co spowoduje zwiększenie się
czasów retencji porporcjonalnie do spadku szybkości przelotu gazu nośnego.
np. trzy kwasy tłuszczowe: C12, C14 i C18, każdego tyle samo, przeprowadzamy
metylację, jak będzie wyglądał wykres komputerowy ich szczytów, otrzymany w
wyniku przerowadzenia chromatografii GLC przy założeniu, że kwas C18 uległ
jedynie częściowej metylacji? - Poza szczytem rozpuszczalnika pojawią się 3 piki.
Pierwszy to pik estru kwasu C12, następnie C14, potem C18, ponieważ wraz ze wzrostem
długości łańcucha kwasu tłuszczowego maleje lotność i wydłuża się czas retencji. Długość
łańcucha jest jedyną cechą różniącą te estry. Piki C12 i C14 mają identyczną powierzchnię,
ponieważ ilości tych estrów są równe. Powierzchnia piku C18 jest mniejsza, ponieważ nie
cały kwas tłuszczowy C18 został zmetylowany i jego estru jest mniej. Po znacząco
dłuższym RT może pojawić się pik dimerów kwasu C18, który nie został całkowicie
zmetylowany.
np. W probówce B mamy kwas nukleotydowy. Przelewamy do probówki A i robimy
hydrolizę kwasową i do C - hydrolizę zasadową. Przykładowe rozwiązanie: A <---- B ----
> C Do probówki A dodajemy UMP. Przeprowadzamy HPLC w fazie odwróconej i na
wykresie komputerowym widzimy 5 szczytów (poza szczytem rozpuszczalnika).
Pytanie: czy w B było DNA czy RNA? tabelka do uzupełnienia, zaznaczyć czy w danej
reakcji powstaje barwny produkt (+) czy nie powstaje ( ) - W probówce było RNA. Po
kwaśnej hydrolizie RNA otrzymano 2 rodzaje zasad purynowych (adeninę i guanine),
rybozę, kwas ortofosforowy i UMP i CMP (razem powinno być 6 pików  czyżby komputer
nie wykrywał piku kwasu fosforowego?). Dodanie do próbki UMP nie zmieni liczby pików,
jedynie zwiększy powierzchnię piku dla UMP. Gdyby w próbce było DNA, dodanie UMP
(w którym zasadą azotową jest uracyl) spowodowałoby pojawienie się dodatkowego piku,
ponieważ w DNA nie występuje uracyl.
Bial Dische molibdenian
A + +
B +(jeśli odczynnik + (jeśli odczynnik +
hydrolizuje RNA) hydrolizuje RNA)
C + (o ile zakwaszono + (o ile zakwaszono + (jeśli założyć, że
po hydrolizie) po hydrolizie) wykrywany też P
związany)
Inna możliwość, wg mnie błędna, ale pasująca do wersji  5 pików
W probóce B było DNA. Po hydrolizie DNA w kwasie otrzymano nukleotydy 4 zasad, które
dały 4 piki, ponieważ każdy rodzaj nukleotydu (inna zasada azotowa) ma inny czas retencji.
Piąty pik pochodzi z UMP, który jest produktem hydrolizy tylko RNA, nie DNA. Gdyby w
probówce B był RNA, dodanie UMP nie zmieniłoby liczny pików i byłyby nadal widoczne
4 piki.
7. Sączenie molekularne:
charakterystyka żelu typu Sephadex - Sephadex (sito molekularne) jest to żel
wykorzystywany w technice sączenia molekularnego, która służy do rozdzielania związków
wielkocząsteczkowych (np.białka) od drobnocząsteczkowych (np. nukleotydy) lub dwóch
związków wielkocząsteczkowych (np. dwóch białek). Ziarna żelu typu Sephadex
zbudowane są z usieciowanego polisacharydu  dekstranu. W zależności od tego co chcemy
rozdzielać powinniśmy dobrać żel, którego ziarna zawierają pory o odpowiedniej śrenicy.
Dla rozdzielenia związków drobnocząsteczkowych od wielkocząsteczkowych średnica
porów powinna być większa niż średnica cząsteczki związku mniejszego, ale mniejsza niz
średnica cząsteczki związku większego. Z kolei do rozdzielenia dwóch związków
wielkocząsteczkowych różniących się nieznacznie masami (np. dwa białka o masach 30 i 40
kDa), powinniśmy przed dobraniem odpowiedniego żelu zwrócić uwage na strukture
przestrzenną rozdzielanych związków, gdyz mimo dużej masy związek o strukturze
fibrylarnej może łatwiej wnikać do wnętrza porów niż związek o zbliżonej masie ale o
strukturze globularnej.
np. rozdzielanie białek o zbliżonych masach ( 20 i 30 kDa). Dlaczego mogło się nie
powieść? - Przyczyny to: 1) z
le dobrany żel (zbyt małe/duże pory w ziarnach żelu) oraz
zblizona masa obu białek ( oba białka są związkami wielkocząsteczkowymi i
prawdopodobnie żaden z nich nie wnikał do wnętrza porów w ziarnach żelu) 2) nieznana
jest nam struktura przestrzenna ( struktura 3-rzędowa) obu tych białek, jedno z nich moze
być fibrylarne a drugie globularne, albo oba mogą być albo takie albo takie, co powoduje
różnice w łatwości wnikania do porów ziaren żelu, a co za tym idzie wpływa na szybkość
przepływu rodzielanego roztworu przez kolumne. Aby rozdzielić te białka nalezy
zastosować żel o ziarnach z porami o średnicy większej niż wielkość cząsteczki białka o
masie 20 kDa ale mniejszej od cząsteczki białka o masie 30 kDa, dzięki czasmu pierwsze
białko będzie wnikac do porów  mniejsza szybkość przepływu przez kolumne, natomiast
drugi nie będzie wnikać i dużo szybciej przepłynie przez kolumnę.
8. Napisać:
np. dwa pentapeptydyo podobnych punktach izoelektrycznych, ale zbudowane z
różnych aminokwasów - Dwa kwaśne to Glu i Asp; trzy zasadowe aminokwasy to Arg, His
oraz Lys; Ser i Thr mają po jednej grupie  OH; przykładowe pentapeptydy: Ile-Val-Glu-
Ser-Gln oraz Leu-Ala-Asp-Thr-Asn
np. trzy aminokwasy o wyraz
nie rosnącej polarnosci podstawników, nazwac - Ala,
Ser, Asp lub Ala, Asn, Asp  te dwa ciągi są wg mnie najlepsze, ponieważ wszystkie
aminokwasy zawierają tyle samo  CH2-, więc różnią się wyłącznie grupami funkcyjnymi
zmieniającymi polarność
np. dipeptyd złożony z aminokwasu o podstawniku hydrofobowym i aminokwasu o
podstawniku obdarzonym ładunkiem - Alanyloasparagina (Ala-Asn) lub Pronylolizyna
(Pro-Lys)
9. Narysować:
np. narysowac i nazwać dowolny nukleotyd - Wiązania występujące w ATP
[adenozynotrifosforan]: wiązania bezwodnikowe między resztami kwasu fosforowego
[zwane też "wysokoenergetycznymi"], wiązanie fosfoestrowe między węglem cukru, a
tlenem pierwszej reszty kwasu, wiązanie N-glikozydowe między zasadą azotową, a węglem
cukru. Należy znać numery węgli tworzących wiązania
umieć narysować każdą z zasad azotowych -
 np. narysować i nazwać dipeptyd z aminokwasu o niepolarnej i polarnej
niedysocjujacej grupie - Alanyloseryna (Ala-Ser)
Uwaga! Mimo wielokrotnej korekty dokonanej przez kilka osób w tym pliku mogą nadal być
jakies większa lub mniejsze błędy :)
The End ;)
przygotowali Q, Grubs i MegaEgo


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
kolos2005
kolos2
kolos2
fiz przygotowanie kolos kolos2 pyt
Systemy Mobilne kolos2
Kolos2 pytania
wydymka kolos2
fiza kolos2
PSYB Kolos2

więcej podobnych podstron