Denaturacja biaÅ‚ek oraz odczyny barwne na aminokwasy i biaÅ‚ka RozdziaÅ‚ VI, ćw. 6.9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18 STRUKTURA BIAAEK lð PodstawowÄ… jednostkÄ™ budulcowÄ… biaÅ‚ek stanowiÄ… aminokwasy lð Aminokwasy zawierajÄ… grupÄ™ aminowÄ… i grupÄ™ karboksylowÄ… lð W roztworach wodnych grupy te mogÄ… ulegać jonizacji, tworzÄ…c odpowiednio NH3+ i COO- lð Obecność tych grup odpowiada za amfoteryczny charakter aminokwasów lð W biaÅ‚kach wystÄ™puje 20 typów aminokwasów lð Można je podzielić za wzglÄ™du na charakter grup bocznych lð Atom wÄ™gla do którego przyÅ‚Ä…czana jest grupa boczna (skrótowo R), nazywany jest wÄ™glem Ä… lð BiaÅ‚ka sÄ… liniowymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów lð Aminokwasy w biaÅ‚kach poÅ‚Ä…czone sÄ… wiÄ…zaniami peptydowymi, tworzonymi w reakcji grupy aminowej jednego aminokwasu z grupÄ… karboksylowÄ… drugiego aminokwasu lð BiaÅ‚ka mogÄ… być zbudowane z kilkuset do nawet kilku tysiÄ™cy aminokwasów lð Każdy aminokwas ma przypisany trzyliterowy skrót oraz standardowy jednoliterowy symbol: lð Terminalna części biaÅ‚ka nazywane sÄ… N-koÅ„cem i C-koÅ„cem, ponieważ majÄ… wolne grupy NH3+ i odpowiednio COO- lð SekwencjÄ™ biaÅ‚ek podaje siÄ™ od N-koÅ„ca do C-koÅ„ca : MFSMRIVCLVLSVVGTAWTADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERHQSACKD Struktura pierwszorzÄ™dowa biaÅ‚ek sekwencja (kolejność) aminokwasów w Å‚aÅ„cuchu biaÅ‚kowym: >sp|P00734|THRB_HUMAN Prothrombin OS=Homo sapiens GN=F2 PE=1 SV=2 MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHSQHVFLAPQQARSLLQRVRRANTFLEEVRKGNL ERECVEETCSYEEAFEALESSTATDVFWAKYTACETARTPRDKLAACLEGNCAEGL GTNYRGHVNITRSGIECQLWRSRYPHKPEINSTTHPGADLQENFCRNPDSSTTGP WCYTTDPTVRRQECSIPVCGQDQVTVAMTPRSEGSSVNLSPPLEQCVPDRGQQY QGRLAVTTHGLPCLAWASAQAKALSKHQDFNSAVQLVENFCRNPDGDEEGVWCY VAGKPGDFGYCDLNYCEEAVEEETGDGLDEDSDRAIEGRTATSEYQTFFNPRTFG SGEADCGLRPLFEKKSLEDKTERELLESYIDGRIVEGSDAEIGMSPWQVMLFRKSP QELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDKNFTENDLLVRIGKHSRTRYERNIEKISML EKIYIHPRYNWRENLDRDIALMKLKKPVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYKGRV TGWGNLKETWTANVGKGQPSVLQVVNLPIVERPVCKDSTRIRITDNMFCAGYKPDE GKRGDACEGDSGGPFVMKSPFNNRWYQMGIVSWGEGCDRDGKYGFYTHVFRLK KWIQKVIDQFGE lð Cztery atomy tworzÄ…ce wiÄ…zanie polipeptydowe leżą w jednej pÅ‚aszczyznie i nie majÄ… swobody rotacji (wiÄ…zanie peptydowe ma charakter wiÄ…zania częściowo podwójnego, na skutek delokalizacji elektronów) lð Możliwość przyjmowania przez Å‚aÅ„cuch polipeptydowy różnych konformacji w przestrzeni wynika przede wszystkim z rotacji wiÄ…zaÅ„ miÄ™dzy atomem azotu grupy aminowej a atomem C Ä… oraz miÄ™dzy atomem wÄ™gla grupy karboksylowej a C Ä… lð Przyjmowanie przez biaÅ‚ko wÅ‚aÅ›ciwej konformacji odbywa siÄ™ w trakcie procesu zwijania biaÅ‚ka lð Przebieg zwijania determinujÄ… oddziaÅ‚ywania przyciÄ…gajÄ…ce i odpychajÄ…ce pomiÄ™dzy rożnymi aminokwasami w biaÅ‚ku oraz miÄ™dzy aminokwasami a czÄ…steczkami wody lð Wiele biaÅ‚ek ma wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci katalizowania reakcji chemicznych biaÅ‚ka taki nazywa siÄ™ enzymami lð Struktury przestrzenne wielu biaÅ‚ek udaÅ‚o siÄ™ poznać dziÄ™ki krystalografii rentgenowskiej Struktura drugorzÄ™dowa biaÅ‚ek Struktury lokalne powstajÄ…ce w wyniku tworzenia siÄ™ wiÄ…zaÅ„ wodorowych pomiÄ™dzy tlenem grupy >C=O, a wodorem grupy -NH, dwóch niezbyt odlegÅ‚ych od siebie w Å‚aÅ„cuchu wiÄ…zaÅ„ peptydowych. Do struktur drugorzÄ™dowych zalicza siÄ™: lð helisÄ™ - gÅ‚. helisÄ™ alfa (ang. Ä… helix) lð beta kartkÄ™ (struktura beta-faÅ‚dowa) tworzÄ…ce "pofaÅ‚dowane kartki" (ang. ² sheet) lð beta zakrÄ™t (pÄ™tle omega) (ang. turn) WiÄ…zania wodorowe: Struktura Å‚aÅ„cucha polipeptydowego i kÄ…ty torsyjne Wykres Ramachandrana Struktury super-drugorzÄ™dowe Struktura trzeciorzÄ™dowa UkÅ‚ad w przestrzeni wszystkich atomów biaÅ‚ka lub podjednostki biaÅ‚ka, bez uwzglÄ™dniania zależnoÅ›ci od sÄ…siednich czÄ…steczek. WarunkujÄ… jÄ… różne wiÄ…zania chemiczne: lð wiÄ…zania dwusiarczkowe (mostki disulfidowe) - należą one do najsilniejszych wiÄ…zaÅ„ miÄ™dzy resztami aminokwasów. PowstajÄ… w wyniku odwodornienia grup tiolowych -SH dwóch cystein znajdujÄ…cych siÄ™ w tym samym Å‚aÅ„cuchu albo w dwóch Å‚aÅ„cuchach polipeptydowych. WiÄ…zania te nadajÄ… trwaÅ‚ość strukturze trzeciorzÄ™dowej. lð OddziaÅ‚ywania jonowe - mogÄ… wystÄ™pować miÄ™dzy grupami aminowymi lub guanidynowymi Å‚aÅ„cuchów bocznych aminokwasów zasadowych (Lys, Arg, a grupami karboksylowymi aminokwasów kwaÅ›nych (Asp, Glu) lð OddziaÅ‚ywania hydrofobowe pomiÄ™dzy Å‚aÅ„cuchami bocznymi aminokwasów hydrofobowych (alifatycznych i aromatycznych) Struktura czwartorzÄ™dowa Wzajemne uÅ‚ożenie podjednostek tworzÄ…cych wiÄ™kszÄ… caÅ‚ość, stanowiÄ…cÄ… aktywne Wzajemne uÅ‚ożenie podjednostek tworzÄ…cych wiÄ™kszÄ… caÅ‚ość, stanowiÄ…cÄ… aktywne biaÅ‚ko zÅ‚ożone. biaÅ‚ko zÅ‚ożone. PrzykÅ‚adami biaÅ‚ek zÅ‚ożonych z kilku podjednostek sÄ…: hemoglobina, fibrynogen, PrzykÅ‚adami biaÅ‚ek zÅ‚ożonych z kilku podjednostek sÄ…: hemoglobina, fibrynogen, polimeraza DNA, kanaÅ‚y jonowe, wirus mozaiki tytoniowej, dehydrogenaza polimeraza DNA, kanaÅ‚y jonowe, wirus mozaiki tytoniowej, dehydrogenaza alkoholowa. alkoholowa. fibrynogen fibrynogen Denaturacja biaÅ‚ek Zmiany konfirmacyjne Å‚aÅ„cucha polipeptydowego na skutek, czego biaÅ‚ko traci swoje typowe, rodzime wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci. Dochodzi do deformacji ksztaÅ‚tu czÄ…steczki, bez hydrolitycznej degradacji Å‚aÅ„cucha polipeptydowego (bez przerwania wiÄ…zaÅ„ peptydowych). NastÄ™puje zaburzenie wiÄ…zaÅ„ stabilizujÄ…cych przestrzenna strukturÄ™ biaÅ‚ek: wiÄ…zania wodorowe miedzy grupami C=O ..... HN wiÄ…zaÅ„ peptydowych, oraz miÄ™dzy grupami funkcyjnymi Å‚aÅ„cuchów bocznych, wiÄ…zania jonowe (grupy -COO i -NH3+, oddziaÅ‚ywania hydrofobowe aminokwasy niepolarne alifatyczne i aromatyczne), wiÄ…zania koordynacyjne za poÅ›rednictwem metali. Zerwanie powyższych wiÄ…zaÅ„ i utworzenie nowych prowadzi do zmiany trójwymiarowej struktury czÄ…steczki biaÅ‚ka. Denaturacja prowadzi do: Utraty wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci biologicznych enzymatycznych, antygenowych, hormonalnych DenaturacjÄ™ powodujÄ… czynniki: lð Fizyczne: temperatura, wysychanie, ultradzwiÄ™ki, promieniowanie, wstrzÄ…sanie wodnych roztworów w atmosferze powietrza lð Chemiczne: kwasy, zasady, jony metali ciężkich, chlorowodorek guanidyny, mocznik, detergenty, fenol, chloroform, alkohole, aceton !!! Nie zawsze denaturacji towarzyszy wypadanie z roztworu - nie zawsze wypadanie biaÅ‚ka z roztworu Å›wiadczy o denaturacji !!! Denaturowane biaÅ‚ko wypada zwykle z roztworu w pI (pH punktu izoelektrycznego) Nie należy mylić denaturacji z koagulacjÄ…!!!! Ćw ic ze nia : s . 2 4 3 -2 4 6 6 ,9 Cieplna denaturacja i koagulacja biaÅ‚ka 6 ,1 0 DziaÅ‚anie rozpuszczalników organicznych 6 ,1 1 StrÄ…canie biaÅ‚ka za pomocÄ… kationów (sole met ciężkich) Fe, Cu i Pb 6 .1 2 StrÄ…canie za pomocÄ… anionów 6.13 Reakcja biuretowa Piotrkowskiego ReakcjÄ™ dajÄ… zwiÄ…zki majÄ…ce, co najmniej 2 przylegajÄ…ce do siebie wiÄ…zania peptydowe. Dwa przylegÅ‚e wiÄ…zania peptydowe tworzÄ… wiÄ…zanie koordynacyjne z atomem miedzi barwny kompleks. Nazwa pochodzi od biuretu zwiÄ…zku powstajÄ…cego przy ogrzewaniu mocznika do 180°C. 6.14 Reakcja ninhydrynowa (s. 246) Aminokwasy pod wpÅ‚ywem ninhydryny ulegajÄ… utlenieniu, dekarboksylacji i deaminacji poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku wÄ™gla i aldehydu uboższego o 1 atom wÄ™gla. W obecnoÅ›ci powstaÅ‚ego amoniaku zredukowana czÄ…steczka ninhydryny ulega reakcji kondensacji z utlenionÄ… czÄ…steczkÄ… ninhydryny i powstaje fioletowoniebieski produkt kondensacji. 6.17. Reakcja Sakaguchi na argininÄ™ Grupa guanidynowa argininy w zasadowym roztworze z Ä…-naftolem daje czerwony kompleks Arginina: Arg, R 6.18 Reakcja cystynowa BiaÅ‚ka w czasie ogrzewania z Å‚ugiem ulegajÄ… hydrolizie. Siarka cysteiny i cystyny ulega uwolnieniu w postaci jonów siarczkowych. S- z jonami Pb2+ czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku tej reakcji.