TAJEMNA
SEKRETNA
UKRYTA
KOMNATA
PATOGENU
 FG
ikrobiologia 1
Pobieranie materiałów do badań bakteriologicznych.
Metody hodowli bakterii tlenowych i beztlenowych.
M 1. Notatki te powstały dzięki Patriszi, dzięki której otrzymałem
największy zbiór ręcznie robionych zapisków z ćwiczeń.
Zachęcam do polubienia jej fanpejdża! Oprócz tego wielkie
podziękowania dla Oli, której inskrypcje już od dawna dopełniają moje oraz dla Basi i Kasi.
Moja własna rola jest doprawdy znikoma.
2. Większość błędów w diagnostyce mikrobiologicznej wynika z niewłaściwego pobrania
materiału!
3. Pacjent może sam pobrać próbkę moczu, kału czy plwocin. Inne materiały pobiera się w
asyście personelu medycznego. Próbka moczu powinna zawierać 5-10ml oraz być zebrana
wraz z pierwszą mikcją (inaczej niż w diagnostyce laboratoryjnej) lub po czetrogodzinnej
przerwie po ostatniej mikcji. Mocz może być przechowywany w temperaturze 4ºC przez
przysłowiowy dłuższy czas (powiadają że do 4h).
4. Procedura pobierania moczu:
a) przygotowanie jałowego pojemnika
b) umycie rÄ…k
c) obmycie okolicy genitalnej wodą z mydłem
d) rozpoczęcie oddawania moczu do muszli
e) oddanie porcji moczu do pojemnika (bez przerywania - szybcy i wściekli)
f) zamknięcie i opisanie pojemnika
g) oddanie pojemnika do badania. Nie wiem, dlaczego ten pan siÄ™ tak dziwnie do mnie
uśmiecha.
5. U niemowląt życia mocz pobiera się do specjalnej torby przyklejanej w okolicy genitalnej.
Można wykorzystać odruch polegający na odruchowej mikcji po łaskotaniu w okolicy
krzyżowej. Działa on do szóstego miesiąca życia (autor nie bierze odpowiedzialności za
ewentualne pozwy sÄ…dowe).
6. Istnieje możliwość pobrania moczu przez cewnik, ale należy to robić przez port
przeznaczony specjalnie do tego celu (o ile jest obecny). W ostateczności można pobrać
próbkę podczas zmiany cewnika. Mocz z worka nie nadaje się do analizy.
7. Najbardziej inwazyjną metodą pobrania moczu jest ta przez wkłucie nadłonowe. Uzyskuje
się mocz z samego pęcherza, więc bakteriologicznie jest najbardziej wiarygodna.
8. Procedura pobierania plwociny:
a) przepłukanie jamy ustnej wodą i przygotowanie jałowego pojemnika
b) wyjęcie protezy (jeśli się posiada)
c) umycie rÄ…k
2
 FG
d) odkrztuszenie wydzieliny do pojemnika
e) zamknięcie i opisanie pojemnika
f) oddanie pojemnika do badania.
9. Waciki do pobierania wymazów są zrobione z dakronu, ponieważ bawełna jest toksyczna
dla wielu bakterii.
10. Materiał powinno się pobierać z miejsca jak najbliższego temu, w którym toczy się stan
zapalny. Można pobierać z obrębu rany. Jeżeli podejrzewamy bakterię tlenową, to należy
przepłukać ranę i pobrać z jej głębszej części.
11. Płyn mózgowo-rdzeniowy, stawowy i opłucnowy oraz krew to płyny jałowe. Oznacza to,
że w warunkach fizjologicznych nie ma w nich żadnych drobnoustrojów.
12. Najbardziej wartościowym materiałem jest taki, który pobrano w trakcie rozwoju
choroby. Zawiera on największe miano antygenów.
13. Materiał biologiczny powinno się dostarczyć do laboratorium w przeciągu dwóch
godzin. Jeżeli z jakichś przyczyn nie można, to trzeba go zakonserwować (w różny sposób,
w zależności od rodzaju próbki). Istnieją także specjalne podłoża transportowe, które
umożliwiają wzrost wybranych hodowli w warunkach polowych.
14. Podłoże ciekłe do hodowli bakterii zawiera bulion wołowy, peptony oraz substancje
wzbogacajÄ…ce.
15. Typową substancją wzbogacającą jest krew. Najczęściej używa się krwi baraniej, końskiej
lub "przeterminowanej" krwi ludzkiej. Podłoża takie to konwencjonalne podłoża stałe.
16. Podłoże może wymagać także pyłu węgla drzewnego, agaru, krzemionki, nafty, soli
kwasów żółciowych, fioletu gencjanowego, sproszkowanego rogu jednorożca czy innych
rzadkich składników alchemicznych.
17. Podłoże wybiórcze: umożliwia rozwój tylko jednej wybranej grupy mikroorganizmów.
18. Podłoże MacConkeya: używane w hodowli bakterii Gram (-). Organizmy laktazo-
dodatnie barwią je na różowo.
19. Podłoża typu stos (pionowa probówka) stosuje się w przypadku organizmów
wymagających wysokiej wilgotności lub dłuższego czasu hodowli (woda wolniej
odparowuje).
20. Podłoże czekoladowe może być użyteczne w przypadku hodowli Haemophilus czy
Neisseria.
21. Podłoże Chapmana jest przeznaczone specjalnie dla gronkowców. Zawiera mannitol.
22. Gaspak to specjalny hermetyczny pojemnik, który umożliwia wytworzenie środowiska
redukującego. Dodatkowo komory beztlenowe umożliwiają przetrwanie nawet najbardziej
bezwzględnym beztlenowcom.
3
 FG
23. Mikromanipulator umożliwia odsysanie pojedynczych komórek. Studentom nie wolno
się do niego zbliżać na mniej niż 5m.
24. Obecnie najlepszymi systemami do pobierania krwi są te próżniowe. Strzykawka stanowi
układ otwarty, przez co umożliwia kontakt krwi z powietrzem, wpływając negatywnie na jej
właściwości. Krew z cewnika pobiera się tylko wtedy, gdy podejrzewa się zakażenie
odcewnikowe. Posokę do badań mikrobiologicznych traktuje się 70-procentowym
roztworem etanolu oraz jodyną, a po wyschnięciu umieszcza na podłożu umożliwiającym
wzrost jak największej grupie mikroorganizmów. Badanie krwi wykonuje się optymalnie
przed szczytem gorączki oraz w jej szczycie. Najlepiej przeprowadzić jedną hodowlę w
warunkach tlenowych i jedną w beztlenowych, bo różnie to bywa.
25. Materiał z dróg moczowo-płciowych pobiera się za pomocą specjalnej szczoteczki lub
wacika.
26. Płyn mózgowo-rdzeniowy pobiera się przez punkcję lędz
wiowÄ…. Preparat wymaga 2-3
ml płynu.
27. Bakterie beztlenowe najczęściej spotykane są w ropniach oraz jelitach. Po pobraniu
należy je jak najszybciej umieścić w warunkach beztlenowych. Lubią podłoża złożone z
bulionu zalanego parafinÄ….
28. Hemoliza:
a) ą - zielonkawe zabarwienie związane z obecnością metHb, czyli częściowe zniszczenie
krwinek
b) ² - żółte zabarwienie, caÅ‚kowite zniszczenie krwinek
c) Å‚ - brak hemolizy.
29. Pobieranie próbek po antybiotykoterapii ma sens:
A) przynajmniej trzy dni po domiejscowym podawaniu
B) przynajmniej tydzień po ostatniej dawce doustnej.
4
 FG
ikrobiologia 2
Barwienie metodÄ… Grama. Inne metody barwienia.
Wybrane testy identyfikacyjne w diagnostyce
bakteriologicznej.
M
1. Barwienie Grama:
1) nanieść kroplę hodowli + 1-2 krople soli fizjologicznej
2) przenieść 3 razy szkiełko nad płomieniem palnika
3) nanieść fiolet krystaliczny na 2-3 minuty
4) przepłukać preparat płynem Lugola i odczekać 2 minuty
5) przepłukać przez pół minuty roztworem acetonu w 90-procentowym roztworze etanolu
6) spłukać wodą destylowaną
7) nanieść fuksynę na pół minuty
8) spłukać wodą i umieścić pod mikroskopem
9) podawać w miseczkach ze świeżym chlebem i tartym parmezanem.
2. Bakterie Gram (+): posiadają ścianę komórkową zbudowaną z peptydoglikanów, które
tworzą kompleksy z jodem. Pod wpływem etanolu dochodzi do denaturacji tetra-peptydów,
dzięki czemu zamykają się pory błonowe pomiędzy warstwami mureiny, a kompleks jodu z
fioletem krystalicznym zostaje zatrzymany wewnątrz ściany. Barwią się one zatem na
fioletowo.
3. Bakterie Gram (-): posiadają ścianę zbudowaną z kilku warstw peptydoglikanów. Jest ona
zbyt mała, by zatrzymać fiolet. Po działaniu alkoholem błona zewnętrzna zostaje niemal
całkowicie zniszczona, a fosfolipidy ulegają ekstrakcji. Działanie fuksyną nadaje barwę
różową lub czerwonawą.
4. Barwienie Shaeffera-Fultona:
1) naniesienie materiału na szkiełko
2) przeniesienie nad palnik
3) naniesienie zieleni malachitowej
4) przeniesienie nad palnik do czasu zaobserwowania oparów
5) po ostygnięciu przemycie preparatu wodą
6) można użyć pomocniczo fuksyny
Metoda umożliwia uwidocznienie sporów (czyli przydatna w badaniu Bacillus i Clostridium).
5. Staphylococcus aureus: posiada w ścianie komórkowej koagulazę związaną oraz CF. W
kontakcie z osoczem powoduje ona aglutynację, która jest tak silna, że można ją obserwować
gołym okiem na szkiełku - tworzą się charakterystyczne "skrzepy". Występuje u 30 %
populacji. Jest odporny na ²-laktamy, wiÄ™c należy go wyleczyć przed zabiegami
operacyjnymi.
6. Test ASO jest przydatny do identyfikacji paciorkowców ²-hemolizujÄ…cych (np.
Streptococcus pyogenes). Pozwala on wykryć przeciwciała anty-streptolizynowe. Ich miano
5
 FG
powyżej 200 jednostek świadczy o trwającym lub przebytym zakażeniu paciorkowcowym.
Bakteria ta jest czynnikiem ostrej choroby reumatycznej. S. pyogenes jest wrażliwy na
bacytracynę, a S. pneumoniae na optochinę oraz żółć.
7. Kiłę diagnozuje się w teście USR - metodzie kłaczkującej z surowicą inaktywowaną.
Wynik jest dodatni, jeżeli w mieszaninie antygenów kardiolipinowych i potencjalnej
surowicy kiłowej pojawią się charakterystyczne skupiska, "kłaczki".
8. Test API: przydatny w diagnostyce większości bakterii gram-ujemnych. Dwadzieścia
mikroprobówek zawiera odwodnione substraty. Dodaje się do nich zawiesinę bakterii, która
(w zależności od możliwości gatunku) przeprowadzi reakcje. W niektórych probówkach
zmiana zabarwienia przebiega samoistnie, a w niektórych trzeba ją uwidocznić za pomocą
papierka lub barwnika wskaz
nikowego.
9. Wymaz z nosa: wacik zwilżony jałową solą fizjologiczną z okolic zmienionych zapalnie
lub pokrytych wydzieliną. Najczęściej używa się podłoża Chapmana (gdy podejrzewany
gronkowiec) lub agaru krwawego czy czekoladowego (pomocnego przy stanach zapalnych
śluzówki).
10. Wymaz z gardła: należy unieruchomić język szpatułką, a następnie bardzo ostrożnie
(unikając kontaktu z językiem, języczkiem, zębami i resztą zawartości jamy ustnej) pobrać
materiał z tylnej ściany gardła, podniebienia lub migdałków.
11. Jednostka wzrostowa: grupa komórek bakteryjnych, które utrzymują wspólną strukturę
po podziale czy rozdziale (np. dwoinka lub gronko).
6
 FG
ikrobiologia 3
Szczegółowa diagnostyka mikrobiologiczna na
przykładzie moczu. Oznaczanie wrażliwości bakterii
na antybiotyki.
M
1. W obrębie dróg moczowych najczęściej rozwijają się
drobnoustroje: Enterobacteriaceae, Enterococcus, Staphylococcus
aureus, liczne gram-ujemne, Candida albicans. W próbce moczu
powinny występować nie więcej niż 3 gatunki bakterii. Większa ilość może świadczyć o
zanieczyszczeniu. W warunkach szpitalnych częste są dwa. Natomiast zwykle jeden.
2. Każdy drobnoustrój w moczu pobranym z wkłucia nadłonowego jest czynnikiem
etiologicznym.
3. Mocz pobrany metodami konwencjonalnymi jest interpretowany ilościowo. Wyróżnia się
następujące metody:
a) bakteriologiczna jakościowa: hodowla na podłożu McConkey'a lub krwawym,
zasiedlonym dzięki ezie lub mikropipecie
b) bakteriologiczna ilościowa: bezpośrednia ocena mikroskopowa
c) ilościowa zanurzeniowa uproszczona: zanurzenie w badanej próbce płytki zawierającej
różne podłoża wzrostowe, a następnie inkubacja
d) pośrednia - badanie czynników ograniczających wzrost bakterii: ocena parametryczna
moczu (kwasowość, ciężar właściwy, itd.)
4. Liczebność bakterii:
a) do 100 - wynik ujemny, chyba że są to bakterie E. coli
b) do 1000 - wynik ujemny dla dorosłego, dodatni dla dziecka
c) do 10 000 - wynik prawdopodobnie dodatni
d) powyżej 100 000 - wynik dodatni na amen.
5. Posiew bakterii wykonuje się tak: pionowa linia, a potem zygzak wokół osi, którą ona
stanowi. Po zakończonej hodowli liczy się kolonie - wynik jest dodatni, jeśli ich liczba
przekroczy 100.
6. W ocenie lekowrażliwości bakterii bytujących w moczu przydatna jest metoda
dyfuzyjno-krążkowa. Polega na umieszczeniu krążków nasączonych różnymi
antybiotykami w odpowiedniej odległości od siebie na specjalnie spreparowanej hodowli
(nanoszonej w postaci kratki z przekątną). Po okresie inkubacji mierzy się średnice stref
zahamowania wzrostu. Pomiaru oporności na jeden antybiotyk dokonuje się za pomocą
testu paskowego - jeden pasek jest nasączony w różnym stopniu antybiotykiem. Strefa
zahamowania rozciÄ…ga siÄ™ od pewnego punktu w kierunku silniej nasÄ…czonego bieguna.
7. ZwiÄ…zki ²-laktamowe (jak penicylina, cefalosporyna, cefamycyna, monolaktamy,
karbapenemy) zaburzają proces syntezy ściany komórkowej.
7
 FG
8. Aminoglikozydy blokują syntezę białek i niszczą błony plazmatyczne. Są skuteczne
przeciwko większości gram-ujemnych, natomiast zupełnie nie działają na beztlenowce.
9. Związki makrolidowe, glikopeptydy (G+) i tetracykliny też hamują syntezę błon. A
linkozamidy białek. A chinolony blokują gyrazę DNA. A sulfonamidy szlaki kwasu
foliowego.
10. Różnica między antybiotykiem a chemioterapeutykiem jest taka, że ten drugi nie ma
wzorca w przyrodzie. Został sztucznie zsyntetyzowany jako coś nowego.
11. Efekt postantybiotykowy: wzmożony wzrost populacji bakterii po spadku stężenia
antybiotyku.
12. Lek zależny od stężenia: taki, który efektywnie niszczy bakterie w krótkim czasie -
podaje się rzadko, ale w dużej ilości (np. aminoglikozydy).
13. Lek zależny od czasu: wymaga stosowania w dłuższym okresie, by efektywnie zniszczyć
bakterie. Podaje siÄ™ mniejsze iloÅ›ci przez dÅ‚uższy czas (np. ²-laktamy).
14. Antybiotyki mogą wykazywać wzajemne interakcje:
a) addycja - działanie zsumowane, czyli siła dwóch antybiotyków: 3/10 + 2/10 => 5/10
b) synergizm - wzajemne wzmocnienie, siła: 3/10 + 2/10 => 8/10
c) antagonizm - przeciwdziałanie, siła: 3/10 + 2/10 => 1/10.
15. Typy oporności bakteryjnej:
a) kliniczna
b) farmakologiczna
c) mikrobiologiczna
A) wertykalna (pochodzÄ…ca od mikroprzodka)
B) horyzontalna (koniugacja, transdukcja, transformacja).
8
 FG
ikrobiologia 4
Diagnostyka gruz
licy. Sterylizacja i dezynfekcja.
1. Mycobacterium: tlenowe pałeczki, wytwarzające formy
ziarnowate, wykazują kwasooporność. Posiadają
charakterystyczne kwasy mykolowe. AtakujÄ…
M
wewnątrzkomórkowo makrofagi, przyczyniając się do
tworzenia gruzełek - guzków typowych dla przewlekłego
procesu zapalnego, nacieczonych limfocytami oraz makrofagami (najczęściej w miąższu
płucnym). Mogą być saprofitami. M. tuberculosis wywołuje gruz
licÄ™, a M. lepreae trÄ…d.
Hodowla na podłożu trwa 7 dni do 7 tygodni (w zależności od szczepu). Oprócz gruz
licy
występuje także mykobakterioza (powodowana przez M. avium, M. intracellulare, M. kansasii,
M. ulcerans).
2. Zakażenia odbywają się drogą kropelkową lub kontaktową, przy czym już niewielka
liczba prątków może wywołać infekcję. Patogen występuje głównie na terenie Azji oraz
Europy Wschodniej. W 95 % przypadków choroba ma postać płucną, ale należy pamiętać, iż
ma także powinowactwo do innych tkanek. Nieco częściej chorują mężczyz
ni i osoby z gęsto
zaludnionych miast.
3. PrÄ…tki gruz
licy to mali oportuniści, którzy atakują osoby osłabione immunologicznie.
4. Materiał diagnostyczny: plwocina, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn wysiękowy,
popłuczyny żołądkowe, mocz, materiał sekcyjny. Plwocinę należy pobierać rano (ze
względu na największą ilość zgromadzoną w drogach oddechowych). W laboratorium
zagęszcza się ją metodą wirową, ewentualnie rozcieńcza solą fizjologiczną. Można
wykonywać reakcję PCR lub hybrydyzację.
5. Podłoża dla rozwoju bakterii zawierają kwas palmitynowy, węgiel 14C, który potem trafia
do produkowanego przez niÄ… CO i zieleÅ„ malachitowÄ… (podÅ‚oże Löwensteina-Jensena).
2
Lubią też jaja, mąkę ziemniaczaną. Można również wykorzystać przezroczyste podłoże
Middlebrooka, które pozwala wykryć małe kolonie, gdy nie mamy zbyt dużo czasu na
hodowlę. Przyrost kolonii przypomina "kalafiorki z bułką tartą". Prątki preferują wysokie
temperatury (38 - 42 ºC). Metoda Ziehla-Neelsena:
1) barwienie fuksynÄ… karbolowÄ…
2) podgrzanie nad palnikiem
3) zlanie barwnika
4) przepłukanie roztworem 3 % HCl w etanolu
5) naniesienie błękitu metylenowego na dziesięć minut
6) spłukanie wodą destylowaną, osuszenie i oglądanie pod imersyjnym mikroskopem
świetlnym. Prątki powinny się w tym badaniu wybarwić na czerwono.
6. Gruz
licę utajoną wykrywa się za pomocą próby tuberkulinowej czyli podskórnego
wszczepienia tuberkuliny. Odczyn zapalny ocenia się za pomocą średnicy (norma to 15 mm).
9
 FG
7. Test t-spot umożliwia wykrycie wydzielania IFN-ł przez uczulony limfocyt T.
Wykonywany z krwi. Może zostać zweryfikowany przez test GenoType.
8. Leczenie gruz
licy: dwa miesiące terapii skojarzonej. Stosuje się między innymi
paraaminosalicylany, etambutol, rifampicynę i izoniazyt. Jeżeli bakteria cechuje się
obecnością struktur MDR (Multi-Drug Resistance; znów odsyłam do Cytobiologii, by tradycji
stało się zadość), to terapię wydłuża się do dwóch lat. Symbol XDR oznacza, że bakteria
wykazuje całkowitą odporność na leki pierwszego rzutu. Jest oporna jak cholera lub inny
trÄ…d.
9. Antyseptyka: ograniczenie potencjalnych z
ródeł zakażeń z powierzchni tkanek żywych.
10. Aseptyka: ograniczenie możliwości zakażenia tkanek żywych i przedmiotów.
11. Dekontaminacja: całkowite usunięcie drobnoustrojów z danej przestrzeni.
12. Dezynfekcja: wyeliminowanie drobnoustrojów patogennych w postaci wegetatywnej
(czyli spory mogą przetrwać). Za pomocą środków chemicznych takich jak jodyna,
formaldehyd, perhydrol, etanol lub fizycznych: UV, gotowanie, pasteryzacja (65ºC przez 30
minut), tyndalizacja (pasteryzacja przez trzy dni), para wodna, suche powietrze, mrożenie
(tlenek etylenu, plazma, promienie jonowe).
13. Sterylizacja: usunięcie drobnoustrojów w formach wegetatywnych oraz
przetrwalnikowych. Można mierzyć jej skuteczność za pomocą wskaz
ników biologicznych,
chemicznych i fizycznych.
10
 FG
ikrobiologia 5
Wybrane zagadnienia dotyczÄ…ce mykoplazm i
chlamydii. Ogólne właściwości wirusów i metody ich
namnażania.
M
1. 10-dniowy zarodek kurzy jest najczęściej
wykorzystywanym obiektem wirusologicznym. Przykre.
Siódmy dzień jest momentem selekcji jaj inkubowanych.
Około 10 % musi zostać z odrzucone z różnych względów. Tak uzyskuje się szczepionki
przeciw grypie. LD50 - dawka wirusa zabijająca 50 % inokulowanych zarodków; TCID50 -
dawka wywołująca efekt cytopatyczny u 50 % zarodków; PFU - ilość wirusa zgromadzona w
jednym mililitrze.
2. Infekowanie jaj:
1) odkażanie powierzchni skorupki
2) obrys zarodka
3) świdrowanie otworu w skorupce specjalną igłą
4) wprowadzenie wirusa
5) zasklepienie otworu parafinÄ…
6) inkubacja jaja przez dwa dni, obracanie go
7) otwarcie jaja i aspiracja płynu z jamy owodniowej jaja.
3. Z uzyskanego płynu można wyizolować wirus. Uzyskany materiał namnaża się w liniach
półciągłych (kilkanaście pasaży; wirusy; celem uzyskania szczepionek). Oprócz tego mówi
się o liniach ciągłych (dotyczy komórek nieśmiertelnych, które mogą pasażować teoretycznie
w nieskończoność).
4. Bakterie atypowe: posiadają zdolność do namnażania się wyłącznie wewnątrz żywych
komórek, gdyż nie mają własnej ściany. Otacza je trójwarstwowa błona lipidowa, błona
plastyczna. PosiadajÄ… niewielki genom i sÄ… zasadniczo najmniejsze z bakterii.
5. Mykoplazma: rośnie na podłożu PRLO. Istoty te nie mają ściany komórkowej, są
amorficzne, malutkie i nie tworzą dużych kolonii. M. hominis tworzy małe i nieregularne
kolonie, ponadto rozkłada argininę, zmieniając barwę podłoża z krwi końskiej na czerwoną.
Często zakaża noworodki podczas porodu, gdyż podobnie jak M. genitalium, może bytować
w drogach moczowo-płciowych, jak i oddechowych. M. pneumoniae rozkłada glukozę.
Zakaża najczęściej dzieci powyżej piątego roku życia oraz starców.
6. Ureaplasma urealyticum: posiada zdolność do rozkładu mocznika. Wraz z chlamydiami
może powodować niegonokokowe zapalenie cewki moczowej.
6. Badanie wirusologiczne wykonuje się z pierwszego strumienia moczu (w przeciwieństwie
do bakteriologicznego). Najczęściej odnotowywanym schorzeniem jest cytomegalia.
11
 FG
7. Chlamydie: bezwzględne pasożyty człowieka, gram-ujemne, wyposażone w błonę
komórkową. Posiadają złożony cykl życiowy. Występują w nim ciałka elementarne, które są
formą inwazyjno-przetrwalnikową. Po wniknięciu przekształcają się w ciałka pierwotne, a
te z kolei w ciałka retikularne, w obrębie których zachodzą podziały mitotyczne.
8. C. trachomatis: występuje bardzo wiele serotypów tego gatunku. Oznacza się je literami
alfabetu. Typy od A, B i C odpowiedzialne są za jaglicę (egipskie zapalenie spojówek). Od D
do K odpowiadają za zakażenia układu płciowego i cewki moczowej, stawów, zespół
Reitera i uogólnione zakażenia u dzieci. U kobiet infekcja może objąć szyjkę macicy, jajniki,
jajowody, a nawet przydatki, skutkując bezpłodnością, a w skrajnych przypadkach
zakażeniem otrzewnej. U mężczyzn zajmuje cewkę moczową, najądrza i prostatę.
Diagnostyka polega na obserwacji wtrętów w materiale pobranym z gardła, pochwy,
nasienia lub mazi stawowej. Można też ELIS
lub PCR cyknąć.
9. C. psitaci: zakażenia odzwierzęce, częste drogą wziewną, powodują atypowe zapalenie
płuc. Oprócz tego występuje C. abortus, który rzadko infekuje ludzkość.
10. Ciałka Negriego: zgromadzenie rybosomów w neuronach hipokampa czy Purkinjego w
móżdżku. Patognomiczne dla wścieklizny.
11. HIV: wirus RNA, posiadający odwrotną transkryptazę, charakterystyczne białka
kapsydu (AgP24, P18), glikoproteiny (GP41, GP120). Zakażenie przebiega w trzech
podstawowych fazach: ostrej (do 3 miesięcy), utajonej (1-15 lat), objawowej (2-3 lat).
DiagnostykÄ™ przechodzÄ… krwiodawcy (RNA, AgP24, testy trzeciej i czwartej generacji,
AgP124, GP120 i GP41) oraz pacjenci przesiani (ELISA, WB).
12. HPV: przenosi się drogą płciową, kontaktową, przezłożyskową. W celach
diagnostycznych namnaża się je w hodowlach komórkowych. Szeroko wykorzystuje się
badania elektroforetyczne (mniej czułe) lub hybrydyzację (bardziej czuła). W badaniu
przeciwciał niska awidność charakteryzuje świeże zakażenie, a wysoka starsze (czyli
generalnie zgodnie z prawidłami immunologii). Typy 16 oraz 18 wykazują działanie silnie
karcynogenne, zwłaszcza względem komórek szyjki macicy.
12
 FG
ikrobiologia 6
Odczyny serologiczne i metody biologii molekularnej
stosowane w diagnostyce wirusologicznej.
1. Najpierw zaczniemy od testów, żeby było z jajem.
M
2. Jednostki chorobowe i metody przydatne w ich diagnostyce:
Choroba
Grypa OZHA, wymaz z gardła i nosa
Zakażenia dróg oddechowych OWD, OIF
Różyczka ELISA, OZHA
Enterowirusy ONt, RT-PCR
HPV PCR, hybrydyzacja
AIDS ELISA, WB, RT-PCR
Cytomegalia OIF, PCR, APAAP, EIA, hybrydyzacja in situ
HCV 1-2 tygodnie od zakażenia: RT-PCR
3-8 tygodni: aminotransferazy
Więcej: Ab-Ag
3. Wirus HPV (zwłaszcza typ 16 i 18) wywiera silnie karcynogenny wpływ na organizm.
4. Odczyn serologiczny: reakcja antygenu z przeciwciałem, która jest możliwa do wykazania
za pomocą jakiejś metody. W diagnostyce używa się ich do oznaczenia nieznanych
przeciwciał za pomocą znanych antygenów (czyli antygenów wzorcowych) lub nieznanych
antygenów za pomocą znanych przeciwciał (wtedy korzysta się z surowicy wzorcowej).
Najczęściej są to antygeny pochodzące z wyizolowanego wirusa lub pobranej od pacjenta
próbki. Przeciwciała pochodzą od pacjenta (najczęściej surowica krwi lub wydzielina).
5. Określenie poziomu przeciwciał IgG w surowicy chorego wymaga:
a) przynajmniej czterokrotnego przyrostu miana w próbkach surowicy pobranych w
odstępie 2-3 tygodni
b) obecności IgM w próbce.
6. Odczyny serologiczne: odczyn neutralizacji (ONt), odczyn immunoenzymatyczny
(ELISA), odczyn immunofluorescencyjny (OIF), odczyn wiązania dopełniacza (OWD),
odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA), odczyn radioimmunologiczny (RIA), odczyn
immunoblotowy typu Western (WB), odczyn aglutynacji cząstek opłaszczonych wirusem ,
odczyn hemolizy radialnej, immunodyfuzja.
7. Odczyn neutralizacji (ONt):
- najczulszy
- najbardziej swoisty
- użyteczny do wykrywania przeciwciał wirusowych obecnych w materiale
- pozwala na identyfikacjÄ™ szczepu wirusa
13
 FG
- szczególnie skuteczny w diagnostyce enterowirusów
- polega na zobojętnieniu wirusa w hodowli przez swoiste przeciwciała
- metoda pracochłonna i wymagająca długiego czasu oczekiwania
8. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay):
- jakościowa i ilościowa metoda pomiaru Ag lub Ab (IgG, IgM, IgA)
- używa się peroksydazy chrzanowej lub fosfatazy alkalicznej
- do znakowania digoksyny
- bezpieczna
- szybka
- Å‚atwa w interpretacji
- zautomatyzowana (jak mawia klasyk: "na Uczelni jest komputeryzacja, ale nie ma
technologizacji")
- skuteczna w diagnostyce wirusów hepatotropowych, większości rotawirusów, zwłaszcza
różyczki
- odmiany:
+ EIA: reakcje immunoenzymatyczne w fazie stałej
+ APAAP: produkt reakcji immunologicznej mostkuje za pośrednictwem antyglobuliny z
kompleksem zawierającym przeciwciało i enzym. Wynik odczytuje się pod mikroskopem.
9. Odczyn immunofluorescencji (OIF):
- używa się izotiocyjanianu fluoresceiny i rodaminy
- służy do wykrywania przeciwciał w surowicy pacjenta
- ma charakter pośredni
- antygeny uzyskuje się z hodowli laboratoryjnych zakażonych danym szczepem
- skuteczny szczególnie w diagnostyce zakażeń dróg oddechowych.
10. Odczyn radioimmunologiczny (RIA):
- stosuje się pierwiastki promieniotwórcze, najczęściej 125J
- wysoka czułość
- metoda niebezpieczna, naraża na promieniowanie
- polega na pomiarze promieniowania izotopu, który jest przyłączony do kompleksu Ab-Ag
- skuteczny do diagnozowania wirusowego zapalenia wÄ…troby typu B.
11. Odczyn wiązania dopełniacza:
- przebiega w kilku fazach:
a) wiązanie dopełniacza przez kompleks immunologiczny
b) dodaje siÄ™ krwinki baranie
c) jeżeli krwinki ulegną hemolizie, to oznacza, że dopełniacz został związany w pierwszej
fazie - wynik ujemny; jeżeli nie ulegną - wynik dodatni, bo dopełniacz nie był związany
- metoda specyficzna, możliwa do zastosowania w niewielu schorzeniach: herpes simplex,
cytomegalia, zakażenia dróg oddechowych
12. Odczyn zahamowania aglutynacji:
- używa się surowicy zawierającej przeciwciała przeciwko antygenom o skłonnościach do
zlepiania krwinek
14
 FG
- roztwór trzeba przygotować, na przykład przez ogrzanie lub adsorpcję kaolinu
- metoda typowo jakościowa
- skuteczny do wykrywania ortomyskowirusów, paramyskowirusów czy różyczki
- odmianÄ… tego odczynu jest test lateksowy
13. Odczyn hemolizy radialnej:
- wykorzystuje się właściwości hemolityczne dopełniacza
- przebieg jest dość złożony:
a) antygen wirusowy opłaszcza powierzchnię erytrocytów
b) erytrocyty miesza się z płynną i podgrzaną agarozą, a następnie przelewa do szalek
Petriego
c) po ostygnięciu w agarozie wybija się dołki i wypełnia je surowicą
d) inkubacja
e) w międzyczasie przeciwciała powinny dyfundować i łączyć się z antygenami na
powierzchni krwinek
f) na koniec dodaje się dopełniacz, który spowoduje lizę erytrocytów z kompleksem Ag-Ab
- wielkość strefy hemolizy świadczy o ilości przeciwciał obecnych w surowicy pacjenta
14. Immunodyfuzja:
- polega na wędrówce przeciwciał i antygenów w żelu agarozowym
- na skutek toru ruchu i reakcji Ab-Ag tworzÄ… siÄ™ charakterystyczne linie precypitacji
- interpretacja linii pozwala na obliczenie stężeń Ab i Ag
- obecnie uważana za przestarzałą, wyparta przez metody immunoenzymatyczne
15. Western Blot (WB):
- przebieg:
a) rozkład enzymatyczny namnożonej i oczyszczonej zawiesiny uzyskanej z materiału
biologicznego
b) rozdział uzyskanego białka w żelu poliakrylamidowym
c) przenoszenie pasem poszczególnych białek na błonę nitrocelulozową, z którą się silnie
wiążą
d) płukanie i suszenie błony
e) pocięcie błony na paski
f) naniesienie surowicy na paski
g) inkubacja (w jej czasie przeciwciała wiążą się z białkami wirusa)
h) odpłukanie niezwiązanych fragmentów
i) dodanie Ab przeciwko ludzkiej immunoglobulinie wyznakowanej enzymatycznie
j) dodanie barwnika do wybarwienia prążków, na których zaszła reakcja
- metoda użyteczna w diagnostyce HIV.
16. Inne Bloty (hybrydyzacje):
- Southern - materiałem jest DNA, hybrydyzuje się go z użyciem sond
- Northern - materiałem jest RNA
- Dot - po hybrydyzacji przenosi się bezpośrednio na filtr, powstają charakterystyczne
kropko-kleksy
15
 FG
- in situ - hybrydyzacja w utrwalonym skrawku tkanki lub rozmazie komórkowym
- Nestet - modyfikacja proceduralna pozwalająca na zwiększenie czułości przy małej ilości
dostępnego materiału.
17. PCR:
- tradycyjny
- Reverse Transcription PCR
- Real Time PCR (jak widzę skrót, to nigdy nie wiem)
- multiplex PCR
- gniazdowy PCR.
18. Dla kobiety ciężarnej (czy raczej jej płodu) najbardziej niebezpieczne są zakażenia
różyczką czy herpesami.
19. Wirus cytomegalii wywołuje efekt cytopatyczny po trzech tygodniach. Powstaje bardzo
charakterystyczny obraz sowich oczu.
20. Rotawirusy wykrywa siÄ™ w kale za pomocÄ… RT-PCR, aglutynacji lateksowej, ELISY,
immunochromatografii. Są one czynnikiem etiologicznym biegunek u dzieci. Można im
zapobiegać stosując szczepienia czternastowalentne fakultatywne.
21. WZW typu B: wirus o częściowo dwuniciowym DNA. HBs jest antygenem
powierzchniowym, który pierwszy pojawia się w surowicy po zainfekowaniu. Po nim HBe,
który uwalnia się podczas translacji białek wirusowych, a na samym końcu rdzeniowy HBc
(on nie opuszcza wątroby). Współwystępowanie wszystkich trzech jest charakterystyczny
dla fazy ostrej. Gdy choroba przechodzi w fazę przewlekłą, dominację zdobywa znów HBe,
a potem HBs. Choroba powoduje błoniaste zapalenie nerek i guzkowate zapalenie tętnic, a w
formie przewlekłej marskość wątroby lub raka tego narządu. Markery w różnych fazach:
Faza Marker
Inkubacja DNA, AgHBs, IgM anty-HBs
Faza ostra DNA, AgHBs, AgHBe, IgM anty-HBc
Zdrowienie Ab anty-HBe i anty-HBc, AgHBs
Odporność IgG anty-HBc i anty-HBs
22. Cechą charakterystyczną diagnostyki wirusów jest reguła trójkowa: w surowicy pojawia
się najpierw materiał genetyczny, potem antygeny, a na końcu przeciwciała.
16
 FG
ikrobiologia 7
Diagnostyka mykologiczna.
1. Diagnostyka różni się w zależności od przynależności
systematycznej badanych osobników. Wyróżnia się
diagnostycznie: grzyby drożdżopodobne, pleśniowe
M
(nitkowate), dermatofitowe, dimorficzne (różne tropikalne
grzybice). Cechy wspólne grzybów to między innymi
zawartość chityny w ścianie komórkowej (którą można wybarwić za pomocą bieli
Calcofluor), cudzożywność oraz zdolność do rozkładu celulozy.
2. Najczęściej używane testy to OIF, OWD, ELISA oraz lateksowy.
3. Grzyby drożdżopodobne (np. Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Malassezia furfur)
można hodować na podłożu Sabourauda (agar, glukoza, pepton, antybiotyki hamujące
wzrost bakterii, kwaśne pH), barwi się metodą Grama, a następnie za pomocą szczypiec
Corneta przenosi na szkiełko pokrywane płynem imersyjnym. Pod mikroskopem szuka się
blastospor, elementów pseudogrzybni, artrospor (widoczne po zastosowaniu błękitu
laktofenolowego). Zauważenie chlamydiosporów wskazuje na C. albicans. M. furfur jest
lipofilna - wymaga do rozwoju podłoża zawierającego lipidy (na przykład wzbogaconego
oliwą). Identyfikacja tych grzybów może się także odbywać na podłożu Widro (glukoza,
laktoza, sacharoza, maltoza, galaktoza). Grzyby te wykazują zdolność do asymilacji
związków węglowodanowych i ich pochodnych, m.in. rafinozy, ksylozy, arabinozy. W
szeregu biochemicznym API badanie ma kod 20-AUX.
4. C. albicans posiada w ścianie mannan, a w cytoplazmie enolazę. C. neoformans produkuje
ureazę i posiada w otoczce charakterystyczny polisacharydowy antygen (który swoją drogą
wykazuje dużą heterofilność względem antygenu czynnika reumatoidalnego).
5. Rezerwuarem wielu dermatofitów jest gleba, a naturalnym pożywieniem keratyna. Stąd
posiadają wiele różnych odmian keratynoz. Trichophyton zajmuje włosy, skórę oraz
paznokcie (kuliste mikrokonidia), Epidermophyton paznokcie i naskórek (maczugowate), a
Microsporum włosy oraz paznokcie (wrzecionowate).
6. Podstawowy materiał diagnostyczny to łuski skórne czy opiłki paznokciowe, dlatego że
dermatofity rozwijają się głównie na zewnętrznej powierzchni organizmu. Dermatofity
wzrastają bardzo wolno, bo nawet do miesiąca. Podłoża wzbogaca się o cykloheksymid,
który hamuje wzrastanie złośliwych pleśni. W hodowli T. rubrum wydziela czerwony
barwnik do podłoża, a ponadto wykazuje ujemny wynik ureazowy (żółte zabarwienie). T.
mentagrophytes tworzy białe i mączyste kolonie, jest dodatni w próbie ureazowej (czerwone
zabarwienie). Kolonie M. canis są beżowe i gipsowate, natomiast E. floccosum oliwkowe i
pomarszczone.
7. Grzyby pleśniowe (Aspergillus, Mucor, Penicillium, Scopulariopsis) mogą występować w
glebie, wodzie, na powierzchni różnych przedmiotów, na głowie, między paznokciami, a
17
 FG
nawet w obrębie narządów wewnętrznych. Lubią miejsca wilgotne. Są oportunistami.
Większość z nich daje się identyfikować za pomocą KOH, DMSO (dimetylosulfotlenek) lub
barwienia Grama. Wzrastają na podłożu Sabourauda (z chloramfenikolem) lub podłoże
Czapek-Doxa. Wzrost trwa do 5-7 dni. W zależności od temperatury występują w formie
drożdżopodobnej (27 ºC) lub strzÄ™pkowej (37 ºC). Do barwienia kolonii stosuje siÄ™ laktofenol,
a charakterystycznÄ… strukturÄ… sÄ… konidiofory.
8. Aspergillus: mikroskopowo obserwuje się konidiofory w kształcie kropidła. Posiada
galaktomannan w ścianie. Wzrost trwa 1-2 dni. A. funigatus tworzy kolonie zielone,
ciemniejące z wiekiem. A. flavus formuje kolonie żółte, puszyste. A. niger brunatne lub
czarne, również puszyste.
9. Mucor: wzrasta tylko na podłożu Sabourauda. Tworzy kolonie białe (brunatniejące w
miarÄ™ wzrostu) i puszyste. Wytwarza sporangiofory z kulistymi sporangiami.
10. Scopulariopsis: kolonie w kolorze mlecznej kawy (ach, jak to pobudza mojÄ… wyobraz
niÄ™!),
w miarę starzenia brązowiejące, pofałdowane i posiadające wgłębienie w środku.
11. Penicillium: tworzą trawiastozielone (ach, znowu!) kolonie o szybkim wzroście.
Konidiofory mają trzykrotnie rozgałęzione trzonki, ampułkowate fialidy i zarodniki ułożone
w łańcuszki, przez co całość przypomina pędzelek.
12. Diagnostyka serologiczna grzybów:
- testy lateksowe
- ELISA, RIA
- odczyn precypitacyjny (podwójna dyfuzja w żelu i immunoelektroforeza)
- aglutynacja fluorescencyjna
- OWD
a) Cadida:
- OIF
- hemaglutynacja bierna
- test lateksowy (norma Ab 1:20 - 1: 80, dodatni 1:160)
b) Aspergillus:
- OWD
- odczyn lateksowy (podobne normy).
18
 FG
ikrobiologia 8
Diagnostyka parazytologiczna.
1. Toxoplasma gondii: pierwotniak wewnątrzkomórkowy
atakujący zwierzęta stałocieplne (na przykład renifery).
Rozmnaża się w cytoplazmie komórek jądrzastych. Po
M
zaprzestaniu rozmnażania tworzy cysty. Płciowo rozmnaża się
w enterocytach kotowatych, gdzie tworzy oocysty, wydalane
dalej z kałem. Oprócz tego spotyka się go w formie cyst (w mięsie) czy tachyzoitów
(przechodzą przez łożysko). Można się zarazić przez: łożysko, surowe mięso, ziemię,
kuwetÄ™, zanieczyszczone warzywa i owoce. Wrodzona toksoplazmoza: znaczne
upośledzenie immunologiczne. Dzieci produkują przeciwciała IgG dopiero po szóstym
tygodniu od urodzenia, więc należy przeprowadzić dwa badania: jedno tuż po urodzeniu i
drugie dwa miesiące póz
niej. WzrastajÄ…ce miano sugeruje wynik dodatni.
2. Metody diagnostyki toksoplazmy:
A) próba barwna Sabina-Feldmana (OSF): dodaje sie elementy dopełniacza oraz trofozoity
do badanej surowicy. Następnie poddaje się ją inkubacji, a na koniec nanosi błękit
metylenowy, który wybarwia uszkodzone trofozoity. Podlicza się zniszczone trofozoity - test
jest dodatny, jeśli ponad 50 % się wybarwiło
B) izolacja pasożytów i hodowla mysia lub tkankowa (na materiałach z węzłów chłonnych,
mięśni lub innych tkanek miękkich)
C) test lateksowy
D) metoda serologiczna: pod wpływem T. gondii dochodzi do drobnogrudkowej aglutynacji,
mniej więcej równomiernej.
E) dot-ELISA, PCR (płyn mózgowo-rdzeniowy).
2. Pneumocystis carinii: drobnoustrój oportunistyczny wywołujący śródmiąższowe zapalenie
płuc u osób osłabionych oraz wcześniaków. Pasożyt ten ściśle przylega do pneumocytów,
więc uzyskanie materiału nie jest łatwe. Materiał diagnostyczny: bioptat tkanki płucnej,
płukanka pęcherzykowo-oskrzelowa, płukanka oskrzelowa, plwocina indukowana, wymaz
okołokrtaniowy spod nagłośni (dla hardkorów).
3. Metody diagnostyczne:
A) mikroskopowa: obserwacja cyst (barwienie Grocotta; cysty szare) lub
trofozoitów(barwienie Giemsy; jądro karminowe, a cytoplazma niebieska)
B) OIF: skupiska jasnozielone, tworzące kształt plastra miodu
4. Trichomonas vaginalis: bardzo ruchliwy pierwotniak z grupy wiciowców. Przyjmuje
wyłącznie formę trofozoitu. Powoduje pieczenie i ból cewki moczowej, żółte, pieniące się
oraz cuchnące upławy, częstomocz lub dysurię. Występuje u kobiet i mężczyzn. U obu płci
może przebiegać bezobjawowo, ale u tej ładniejszej rzadko się to zdarza. Przenosi się drogą
seksualną oraz kontaktową, przy czym do zarażenia wystarczy kontakt genitaliów z cieczą
zawierającą kilka osobników (stąd uwaga na baseny, ręczniki, itd.). Materiał diagnostyczny:
19
 FG
wydzielina tylnego sklepienia pochwy lub szyjki macicy, mocz (2-3 dni po lub przed
miesiączką), wydzielina z cewki moczowej, spod napletka, sperma czy wydzielina gruczołu
krokowego (tak Olgo, masz rację, można zrobić biopsję przez odbyt).
5. Diagnostyka:
A) mikroskopowo: nawet bez barwników widać ruchliwe osobniki na szkiełku. Można je
jednak zabarwić safraniną, a nawet zastosować metodę Giemsy lub Papanicolau
B) ewentualną hodowlę prowadzi się na podłożu Diamonda (surowica bydlęca i antybiotyki)
przez 48h
C) badania serologiczne pod kątem antygenów.
6. Diagnostyka parazytów jelitowych:
A) materiał: kał, wymaz okołoodbytniczy (skuteczny w przypadku owsicy czy tasiemczycy),
treść sondy dwunastniczej (w przypadku G. lamblia)
B) koproskopia bezpośrednia: rozmaz w soli fizjologicznej, rozmaz w płynie Lugola,
barwienie hematoksylinÄ… lub trichochromem, metoda Kato-Minry
C) flotacja: zastosowanie rozpuszczalników o ciężarze właściwym większym niż ciężar jaj,
dzięki czemu wypływają one na powierzchnię roztworu (np. roztwór soli kuchennej
Fülleborna czy siarczanu cynku Falusta)
D) sedymentacja: zastosowanie rozpuszczalników o mniejszym ciężarze właściwym, przez
co jaja opadają na dno (np. kranówa typowego Seby)
E) larwoskopia: izolacja i hodowla larw na podłożach agarowych.
7. Trichinella spiralis niekiedy daje się wykryć w badaniu USG czy CT. Tworzy otorbione
larwy w różnych narządach.
8. Diagnostyka Plasmodium falciparum opiera się o rozmaz krwi, który ujawnia większość
form tego pasożyta (trofozoit, schizont, makro- i mikrogametocyt). Cennym wskaz
nikiem
diagnostycznym jest stężenie dehydrogenazy mleczanowej.
9. Taenia saginata czy solium wykrywa siÄ™ poprzez obserwacjÄ™ jaj w kale. Podobnie glisty.
10. Echinococcus wychodzi czasami w badaniach obrazowych.
20


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Czynniki genetyczne w patogenezie chorób przyzębia
Prelekcja 4 Aerosfera jako źródło czynników patogennych dla człowieka
PATOGEN
determinanty patogennosci u candida
Klasyfikacja?kterii i mechanizmy patogenezy?kteryjnej
Stres u dębu a patogeny oportunistyczne
Teoria metody terapeutycznej Yumeiho a patogeneza skoliozy idiopatycznej
Neuroborelioza wybrane aspekty patogenezy, diagnostyki i leczenia
Fibromialgia – patogeneza i trudności
Prelekcja 5 Hydrosfera i litosfera jako źródła czynników patogennych dla człowieka
12 Patogeneza cukrzycyid288
Rola komórki beta trzustki w patogenezie cukrzycy typu 2

więcej podobnych podstron