Obraz4
Czas inkubacji (t)
Wyznaczanie szybkości początkowej (Vo) reakcji enzymatycznej:
a ( pmole)
Vo = tg a = -
b (czas, min)
W wyniku hydrolizy sacharozy przez inwertazę, powstają równomolowre ilości glukozy i fruktozy. Pomiar aktywności enzymu oparty jest na oznaczaniu ilości uwolnionych cukrów redukujących metodą z DNS.
W przypadku inwertazy przyrost produktów reakcji jest proporcjonalny do czasu inkubacji w zakresie co najmniej do 15 minut.
Dzięki temu wystarczy dokonać oznaczenia aktywności w tym przedziale czasu (standardowo - po 10 lub 15 min.) co znacznie upraszcza całe postępowanie.
2.4. Oznaczanie aktywności enzymatycznej:
a) Rozcieńczyć preparat enzymatyczny do oznaczeń aktywności:
500x 1000 x 2500 x 5000 x (tzn. względne stężenie enzymu wynosi 1,0 0,5 0,2 i
0,1 )
b) Oznaczanie aktywności enzymatycznej:
Przygotować 10 probówek ( dwie próby zerowe i po dwie próby dla każdego rozcieńczenia enzymu), do każdej napipetować:
♦ 0,5 ml substratu (0.2 M sacharoza w buforze octanowym o pH 4,7) wstawić próby do łaźni wodnej o temp. 37°C, po wyrównaniu temperatury (po około 3 minutach) rozpocząć reakcję enzymatyczną dodając do poszczególnych par probówek po:
♦ 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonego enzymu (co 30 sekund). Inkubować próby 10 minut, po czym do każdej dodać po:
♦ 2,0 ml odczy nnika DNS. Do prób zerowych dodać po 0,5 ml wody celem uzupełnienia objętości.
Wszystkie próby wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temp. 95° C na 10 minut. Ochłodzić próby pod bieżącą wodą i dokonać pomiaru foto metrycznego przy X = 540 nm wobec próby zerowej.
2.5 Oznaczanie białka w preparacie:
Rozcieńczyć preparat enzymatyczny 50 x (0,1 ml enzymu + 4,9 ml wody destylowanej).
4
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
C Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji hydrolizy pNPP
31737 skanuj0016 produkt (pmole) ~ czas (min) Ryc. 1. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w
IMAG0334 (4) oraz stałej KM Wyznaczanie szybkości maksymalnej reakcji Vmax RównanieLtnewemera -Burka
Obraz (152) Protokół. Brak czasów początkowej reakcji na poszczególne tablice. Sygnatury wynikają ze
Obraz0 (101) Zadanie Wyznaczyć reakcje dla belki przedstawioną na rysunku poddanej działaniu obciąż
49612 Obraz (1729) Zamiast wyznaczać minimalny wymagany przekrój przewodu, można obliczyć dopuszczal
86560 Obraz (2648) 4 8.1 Molekularna teoria szybkości reakcji przejścia. Katodowy współczynnik przej
C. Wyznaczanie szybkości reakcji przy kolojnych stężeniach plrogronlanu Zmiany absorbancy kolejnych
szybkości reakcji chemicznej. 18. Kinetyka reakcji enzymatycznych. Równanie
więcej podobnych podstron