05 2
poszczególnych zbiorniczków. Po powtórnym wysuszeniu wiskozymetru wprowadzić 10 ml badanego 0.002% roztworu DNA i zanotować czasy wypływu roztworu DNA dla poszczególnych zbiorniczków.
Dla każdego zbiorniczka wyliczyć lepkość zredukowaną korzystając z następujących zależności:
r/wl = 0 —*o)/*0
lepkość zredukowana = t/w)/c,
gdzie: i — czas wypływu roztworu DNA, t0 — czas wypływu rozpuszczalnika, c — stężenie roztworu DNA (g/100 ml).
Lepkość istotną [>/] odczytać z wykresu na drodze ekstrapolacji do gradientu 0. Masę cząsteczkową badanych preparatów DNA wyznaczyć ze wzoru: [r;] = K • M\ przyjmując K = 6,9-10-4, a = 0,7.
Ćwiczenie 10.25. Pomiar lepkości jcdnoniciowych preparatów DNA w zasadowych lizatach jąder (N.I. Rjabczenko i wsp. 1975: Radiobiologja, 15:171 174)
Zasada: Podczas denaturacji DNA, kiedy to rozpada się struktura II-rzędowa i następuje rozdzielenie łańcuchów polinukleotydowych, lepkość istotna zmienia się dość silnie, a zmiany te zależą od masy cząsteczkowej i siły jonowej roztworu.
Dla zdenaturowanego DNA Escherichia coli w standardowym roztworze soli wartość współczynnika K (0,4 10 4) i wykładnika potęgi a (0,55) w równaniu na lepkość istotną różnią się dość znacznie od odpowiednich parametrów dla natyw-nego DNA o tej samej masie cząsteczkowej.
Większość metod otrzymywania DNA nie dostarcza preparatów' o masie cząsteczkowej większej niż 107 Da. Wiąże się to z dosyć intensywnym odbiałczaniem DNP, podczas którego dochodzi do znacznej degradacji cząsteczki DNA.
Opracowano bardzo dogodną metodę wiskozy metrycznego oznaczania masy cząsteczkowej jednoniciowego DNA w zasadowych lizatach jąder komórkowych, pozwalającą otrzymać preparaty o średniej masie cząsteczkowej 108 Da. Metoda ta nie wymaga odbiałczania preparatów DNA, ponieważ stwierdzono, że r/w, preparatów DNA z białkiem w roztworze NNE (0,9 M NaCl - 0,1 M NaOH - 0,01 M EDTA) nie zależy od zawartości białka, a jedynie od masy cząsteczkowej DNA.
Na podstawie metody sedymentacyjnej białka ustalono empiryczną zależność [>/] od masy cząsteczkowej DNA w roztworze NNE:
0f] = 1,435-100,727
Materiał: Świeża krew świni.
Odczynniki:
1) 1,2% roztwór alkoholu poliwinylowego w 0,14 M roztworze NaCl.
2) Płyn Hanksa: 8 g NaCl; 0,14 g bezwodnego CaCl2; 0,4 g KCI; 0,2 g MgS03-4H2O; 0,35 g NaHCOjj 0,12 g Na2HP04-12 H20 i 0,06 g KH2P04 uzupełnić wodą do 1 litra. Doprowadzić do pH 7,4 wobec czerwieni fenolowej.
3) 0,25 M roztwór sacharozy z dodatkiem CaCl2 (0,03 M) i cytrynianu sodu (0,01 M).
4) 5% wodny roztwór Tritonu X-100.
51 Roztwór NNE: 0,14 M roztwór NaCl z dodatkiem NaOH (0,1 M) i EDTA (0,01 M).
405
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
05 9. Powtórnie wytrącić DNA przez dodanie Vio objętości CH3COONa (odcz. 9)
IMGP1484 Systemy baz danych Fraza GROUP BY - służy do otrzymywania wartości sumarycznych dla poszcze
IMG422 (3) TO/) SD CS /av fi H s U 53 a
Skan0 Powrót Do Fazy 3 i 2 Po zakończeniu fazy 4 powracasz do fazy 3 i 2. Cały ten proces zajmuje 9
kok0 Angus przechadza! się po domu, ściskając w pyszczkj mysi ogon, który chciał dać Muttł w prezen
Połącz cyfry a rabskie z od powiadający mi jm cyframi rzymskimi% 000¥002S 0^0¥000 ¥ ¥0 •. po k o lo
więcej podobnych podstron