09
Elucję izokratyczną prowadzić za pomocą 50 mM KH2P04 zawierającego 5% roztwór metanolu (odcz. 13), z szybkością przepływu eluentu 1 ml/min. Zapis chromatogramów rozpocząć w momencie nastrzyknięcia próbki na kolumnę i zakończyć po 15 min w przypadku chromatografowania wzorców i po 50 min podczas chromatografowania hydrolizatu DNA.
12. Zarejestrowane chromatogramy zintegrować i wykreślić krzywą kalibracyjną do oznaczeń dt oraz 5-Me-dC (krzywa zależności powierzchni szczytu od ilości wzorcowego związku naniesionego na kolumnę). Sposób przygotowania krzywych pokazano rys. 10.15. Z chromatogramów związków wzorcowych odczytać charakterystyczny czas retencji (R,) dC oraz 5-Me-dC i posługując się nim zidentyfikować szczyty obu związków na chromatogramie hydrolizatu DNA. Na rysunku 10.14 przedstawiono przykładowe chromatogramy uzyskiwane w trakcie rozdziału hydrolizatów DNA przygotowanych według opisanej procedury. Znając powierzchnię szczytów obu związków odczytaną z chromatogramu hydrolizatu DNA, obliczyć ilość nanomoli dC oraz 5-Me-dC w 20 pl hydrolizatu DNA, posługując się przygotowanymi krzywymi kalibracyjnymi. Obliczyć stopień metylacji 2'-deoksycytydyny wyrażony w procentach: stopień metylacji dC = (ilość nmol 5-Me-dC/ilość nmol dC) -100%.
Uwagi:
1) Do wykonania etapu 1. należy bezwzględnie założyć okulary i grube rękawice ochronne.
2) Etap 3. prowadzi do mechanicznego rozdrobnienia zawiesiny tkanki i uwolnienia zawartości komórek do buforu homogenizacyjnego. Mieszanina kwasu HEPES (•Y-hydroksyetylo-l-piperazyno-2-etano-sulfonowego) i jego soli sodowej jest buforem zapewniającym pH 7,4, optymalne dla zachowania całych jąder komórkowych. Ochronie tych jąder przed uszkodzeniem służą również zawarte w buforze mannitol i sacharoza, utrzymujące odpowiednią lepkość i ciśnienie osmotyczne buforu.
3) Uzyskany osad nie jest czystym osadem jąder, zawiera on również dużą ilość innych podstruktur komórkowych. Jeśli wirówka nie ma odpowiednich adaptorów do wirowania w jednorazowych probówkach polipropylenowych, wirowanie homo-genatu należy przeprowadzić w odpowiedniej probówce wirówkowej. Szczególną uwagę należy zwrócić na dokładne zrównoważenie rotora.
4) Podczas inkubacji w etapie 5. dochodzi do lizy jąder pod wpływem laurynianu sarkozylu (detergent rozpuszczający błonę jądrową) i strawienia białek przez prona-zę, również tych zintegrowanych z kwasami nukleinowymi. Odpowiednie pH dla aktywności katalitycznej pronazy zapewnia mieszanina buforowa Tris/HCl. Obecny w buforze lizującym EDTA kompleksuje jony metali, przez co zabezpiecza kwasy nukleinowe przed hydrolitycznym działaniem komórkowych nukleaz zależnych od jonów' metali.
parametry szczytu to: 1) h — wysokość (długość odcinka między wierzchołkiem szczytu a przedłużeniem łinii podstawowej); 2) zakrcskowana powierzchnia szczytu — ograniczona od dołu przez przedłużenie linii podstawowej między odcinkiem poprzedzającym i następującym po szczycie; 3) R, - czas retencji wybaczany poprzez rzut prostopadły wierzchołka szczytu chromatograficznego na oś czasu chromatogramu
429
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
systematycznym - konto księgowe. Formy te mogą być prowadzone za pomocą ksiąg oprawnych oraz luźnych
B-ODDYCHANIE Oddech wspomagany można prowadzić za pomocą maseczki twarzowej, worka ambu lub rurki
metody pracy z grupą w poradnictwie zawodowym strona4 145 PRZEBIEG 1. Prowadzący
Zadanie 2/7 Ciężar C przesuwany jest po pionowej prowadnicy za pomocą linki przerzuconej przez
05 13) Filucnt do rozdziału nuklcozydów za pomocy HPLC: 50 mM KH2P04 - 5% metanol
DSC02994 I. Cienkie folie i preparaty na siateczkach nośnych Badania prowadzone za pomocą transmisyj
4- Badania prowadzone za pomocą panelu punktów sprzedaży koncentrują uwagę na produktach. Stanowią o
11 Sztuczna wentylacja. Wentylację noworodka można skutecznie prowadzić za pomocą worka
Scan20005 piają dyskryminacje kobiet we wszystkich jej formach, oraz zgadzają się prowadzić, za pomo
67565 metody pracy z grupą w poradnictwie zawodowym strona4 145 PRZEBIEG 1. Prowa
DSCN7956 110 Broń i przybory W krajach, w których użytkowanie bobrów jest prowadzone za pomocą od ło
metody pracy z grupą w poradnictwie zawodowym strona4 145 PRZEBIEG 1. Prowadzący
skanowanie0080 2 166 Optyka czym nałożyć na nią za pomocą pipety kilka kropel bada
09 Tabela 10.7. Skład najczęściej stosowanych buforów do elektroforezy Bufor Roztwór
P1010024 (4) Ryc. 7-5*. Pobieranie krwi włośniczkowej za pomocą endoskopu. włosowatą z nicią nasączo
1 ?danie słuchu za pomocą mowy (s 2 33) iBadanie słuchu za pomocą mowy Mowa człowieka zawiera wiele
więcej podobnych podstron