04
octowego, inkubowanych w temp. 25-35cC przez 15 godz. Powstały barwny roztwór wykazuje maksimum absorbancji przy ). = 600 nm. Chemiczna natura powstającego kompleksu barwnego nie jest znana. Stosowanie klasycznej metody Burtona nie pozwala na oznaczanie ilości DNA w ciągu jednego dnia. Przedstawiona modyfikacja tej metody oferuje skrócenie czasu inkubacji do 3 god/. przez podniesienie temperatury do 50°C. Przy takim postępowaniu barwa roztworu nie ulega zmianie po upływie 3 godz., co pozwala na pomiar stężenia DNA w wielu próbkach w czasie jednego dnia. W przeciwieństwie do opisanej w ćw. 10.33 metody oszacowania ilości DNA przez pomiar absorpcji w świetle UV. technika oparta na reakcji z difenyloaminą jest specyficzna dla DNA, a nie dla DNA i RNA.
Materiał: Roztwór DNA.
Odczynniki:
1) DNA, np. z grasicy bydlęcej (cieląt), do wykonania roztworu wzorcowego.
2) 0,005 M roztwór NaOH.
3) I M roztwór HC104.
4) 0,5 M roztwór HCI04.
5) Difcnyloamina.
6) CH3COOH lodowaty.
7) Stężony H2S04.
8) 1,6% roztwór aldehydu octowego.
Wykonanie:
1. Sporządzenie wzorcowych roztworów DNA: stosując DNA (odcz. 1) przygotować roztwór o stężeniu 0,15 mg/ml przez rozpuszczenie DNA w NaOH (odcz. 2) do uzyskania stężenia 0,3 mg/ml, a następnie rozcieńczenie go w stosunku 1:1 kwasem chlorowym (VII) (odcz. 3) i ogrzewanie w temp. 70°C przez 15 min; do sporządzania krzywej wzorcowej pobierać objętości roztworu zawierające: 3, 6, 9, 15, 30 i 60 pg DNA.
2. Sporządzić odczynnik difenyloaminowy przez dodanie 1,5 g difenyloaminy, 100 ml CH3COOH lodowatego, 1,5 ml stężonego H2S04 i 0,5 ml aldehydu octowego.
3. Doprowadzić objętości próbek DNA wzorcowych i badanych do 0,5 ml przez dodanie 0,5 M roztworu HC104.
4. Do każdej probówki dodać 1 ml odczynnika difenyloaminowego sporządzonego według przepisu podanego w etapie 2.
5. Inkubować w temp. 50CC przez 3 godz.
6. Odczytać absorbancję próbek przy ż = 600 nm, sporządzić krzywą wzorcową i na jej podstawie ocenić ilość DNA w próbkach badanych.
Uwagi:
1) Metoda ta pozwala na wykrycie 3 pg DNA.
2) Roztwór wzorcowy sporządzony według procedury opisanej w etapie 1 powinien być przechowywany w temperaturze — 20°C.
3) Odczynnik difenyloaminowy (etap 2.) należy sporządzić bezpośrednio przed użyciem.
434
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
04 2 rr 3. Aktywować celulozę przez, moczenie w roztworach: 10 mM EDTA (odcz. 1 p
0 9 hybrydyzację prowadzić w temp. 42°C przez 2 godz., a następnie dodać tyle /denaturowanej sondy m
zdjęcie3070 - Inkubować w temperaturze 37°C przez 18-24 godz. lub w temp. 44 “C pr
zdjęcie3082 - Próbki inkubować w temp. 37°C przez 24-48 godz. -
Skan02 fci pozostawić w a inkubować przez miano faga; w a wykazującymi inek na płytce), p
Geologia wyklad 4 c.d. F 09 (W 06) Jezioro Aralskie (nazywane przez miejscowych Morzem Aralskim)- b
img053 (48) Temperatura Psychrofile (rosną w niskich temperaturach) Mezofile (rosną w temp. 25-40°C)
- Po zakrzepnięciu dwie płytki inkubować w 20°C (przez 72 godz.) i dwie w 37°C (pr
skanowanie0007 6 Zad. WS37. Dane: w > 0. c = 0,6 i + (—0,3) J + 0,6 k, d = (—4)?+ 3 k w=l/3,v=l/4
Slajd20 Rdzeniowe odruchy obronne cs *_ 0» 4— CS CS CS a o interneuron (hamujący) * Motoneuron
14 Jest to równanie prostej przechodzącej przez punkty o współrzędnych O, Th oraz a, T[(+i. Stąd wn
więcej podobnych podstron