00
Ćwiczenie 10.37. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym (J. Sambrook i wsp. 1989: Molecular cloning. A łaboratory manuał. Book 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, 6.9-6.17)
Zasada: W metodzie wykorzystuje się zależność ruchliwości elektroforetycznej cząsteczek dwuniciowego DNA od jego masy cząsteczkowej w przybliżeniu ruchliwość jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z masy cząsteczkowej DNA. Żele agarozowc pozwalają na efektywny rozdział cząsteczek DNA o długości w przedziale 0,1-60 kpz. Podczas rozdziału cząsteczek DNA innych niż liniowe, ruchliwość elektroforetyczna zależy — na ogół silnie od konformacji. Obecność bromku etydyny w żelu zmniejsza ruchliwość liniowych cząsteczek DNA
0 ok. 15% i może zmieniać konformację DNA występującego w innej formie niż liniowa.
Materiał: Roztwór DNA.
Odczynniki:
1) Bufor elektroforetyczny (lab. 10.7).
2) Agaroza.
3) Roztwór bromku etydyny o stężeniu 10 mg,'ml.
4) Bufor obciążający (tab. 10.8)
Aparatura: Aparat do elektroforezy z wyposażeniem, lampa UV lub transiluminator, mikrowirówka.
Wykonanie:
1. Okleić płytkę do elektroforezy taśmą i umieścić ją na wypoziomowanym stoliku. Przygotować odpowiednią ilość buforu elektroloretycznego (odcz. 1), aby wypełnić zbiornik do elektroforezy i sporządzić żel. Dodać odpowiednią ilość agarozy, zależnie od oczekiwanej długości rozdzielanego DNA (tab. 10.6), do naczynia Erlenmaycra zawierającego odpowiednią ilość buforu do sporządzenia żelu. Zaznaczyć poziom cieczy i zamknąć luźno wlot naczynia np. kawałkiem bibuły.
2. Ogrzewać zawiesinę agarozy aż do jej zupełnego rozpuszczenia. W razie ubytku cieczy uzupełnić jej objętość wodą.
3. Ochłodzić roztwór agarozy do temp. 60' C i, jeżeli jest to wymagane, dodać bromek etydyny (odcz. 3) do końcowego stężenia 0,5 pg/ml.
4. Używając pipety automatycznej wprowadzić niewielką ilość agarozy w miejscu przylegania taśmy do płytki do elektroforezy w celu jej uszczelnienia. Odczekać chwilę do zestalenia agarozy. Umieścić grzebień w płytce tak, aby jego zęby znajdowały się 0,5-1 mm nad powierzchnią płytki. Wylać pozostałość agarozy na płytkę; żel powinien mieć grubość 3-5 mm. Po spolimeryzowaniu żelu (w temp. pokojowej przez 30-45 min) usunąć żel i taśmę i umieścić płytkę w aparacie do elektroforezy.
5. Dodać taką ilość buforu do elektroforezy, aby jego poziom przekraczał o ok.
1 mm poziom żelu. Zmieszać, przez krótkie wirowanie próbki, DNA z buforem obciążającym (odcz. 4). Wprowadzić próbki do studzienek w żelu, używając strzykawki lub pipety.
6. Podłączyć elektrody do źródła prądu tak, aby DNA migrował przez większą część żelu w kierunku anody i ustalić napięcie tak, aby natężenie pola elektrycznego
440
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
06 Ćwiczenie 10.36. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi (J. Sambrook i wsp, 1989: Molecular cloni
00 Ćwiczenie 10.17. Odróżnienie RNA od DNA a) Reakcja orcynolowa. Do 2 probówek
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2015 ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ DNA W ŻELU AGAROZOWYM Agaroz
5 (675) iA.ruuais elektroforezy DNA w żelu migruje: a- od (+) do (-) b- od (-) do (+) c- to zal
Transfer DNA z żelu agarozowego na filtr nylonowy (Southern biot) Materiały: - fil
DSC09 (2) Obraz elektroforezy na żelu agarozowym produktów amplifikacji eksonu 7 genu SM NI, trawio
04 Ćwiczenie 10.5. ranu sodowego) Izolowanie DNA z pełnej krwi z użyciem chloranu (VII) (nadchlo-za
07 Ćwiczenie 10.14. Jednoczesne izolowanie DNA i RNA z materiału biopsyjnego, kultur komórkowych, r
08 Elektroforeza w żelu agarozowym. Żeli agarozowych można używać do rozdziela DNA w stosunkowo sze
03 Odzyskiwanie DNA po elektroforezie w żelu agarozowym. Jeśli stosuje się elektroforezę w żelu aga
04 Ćwiczenie 10.12. Izolowanie RNA z krwi (Y. Zhang, J.J. Yunis 1995: Biotechniąues, 18:789-791) Za
03 10.2.4. Badanie stopnia spolimeryzowania DNA metodą wiskozymetryczną Jedną z powszechnie stosowa
więcej podobnych podstron