img111 3

Ćwiczenie 4.33. Izolowanie białek surowicy wlt|>j|cvcli jony metali (J. Porath i wsp 1975: Naturę, 258:598 599)

Zasada: Większość cząsteczek białkowych w różnym stopniu oddziałuje z jonami metali. Siła tego oddziaływania zależny od struktury przestrzennej cząsteczki (donic ny wiążące jony metali), od zawartości reszt aminokwasowych, które bezpośrednio mogą wiązać jony metali (His, Trp i Cys) oraz od pH otoczenia (optimum w przedziale pH 6 8). Elucję specyficznie zaadsorbowanego materiału umożliwia obniżenie pH i jednoczesne zwiększenie siły jonowej eluentu lub zastosowanie do elucji silnego chelatora jonów dwuwartościowych — EDTA.

Materiał: Surowica krwi człowieka lub świni.

Odczynniki:

1)    Chclating Scpharosc 6B.

2)    20 mM bufor fosforanowy (pH 7,0).

3)    I mg/ml CuS0₄ w buforze fosforanowym (pH 7.0).

4)    100 mM bufor cytrynianowy - 100 mM NaCI (pH 6,0).

5)    100 mM bufor cytrynianowy - 400 mM NaCI (pH 5,0).

6)    KIOmM bufor cytrynianowy - 700 mM NaCI (pH 4,0).

7)    I(X) mM bufor cytrynianowy - 1 M NaCI (pH 3,0).

8)    Roztwór: 50 mM EDTA - I M NaCI.

9)    20% roztwór etanolu.

Wykonanie: Pobrać 5 ml złoża i upakować w plastikowej kolumnie (10-15 ml) /łoże przemyć wodą destylowaną (50 ml), a następnie buforem fosforanowym o pil 7.0 (50 ml). Przepuścić przez kolumnę roztwór CuS0₄ (odcz. 3; 20 ml) w celu związania jonów miedzi ze złożem. W wyniku tego zabiegu złoże powinno zmienić barwę z białej na niebieską. Nadmiar jonów miedzi usunąć przemywając kolumn: buforem fosforanowym (20 ml). Surowicę krwi (10 ml) rozcieńczyć 10-krotnie buforem fosforanowym i przepuścić przez kolumnę. Niespecyficznie zaadsorbowane białka usunąć z kolumny przez ponowne przemycie jej buforem fosforanowym (50 ml). Stosując kolejno bufory cytrynianowe o malejącej wartości pH i rosnącej sile jonowej (50 ml każdego z buforów), eluować z kolumny białka związane / jonami miedzi. Jony miedzi związane ze złożem oraz silnie związane z nimi białku usunąć z kolumny za pomocą 50 ml roztworu: 50 mM EDTA - 1 M Nad Wypływający z kolumny materiał zbierać w 2-mililitrowych frakcjach i metodą spektrofotometryczną (A = 280 nm) oznaczyć frakcje zawierające białko. Kolumnę przemyć wodą destylowaną (50 ml) oraz użyć ponownie lub zakonserwować 20% etanolem (30 ml) i przechowywać w temp. 4°C.

4.8 CHROMATOGRAFIA WYKORZYSTUJĄCA HYDROFOBOWE WŁAŚCIWOŚCI CZĄSTECZEK

Zdecydowana większość makromolekuł ma na tyle skomplikowaną strukturę we* wnętrzną. że można w nich wyróżnić zarówno obszary hydrofilowe eksponowane na zewnątrz cząsteczki w polarnym otoczeniu wody, jak i obszary hydrofobowe

ukryte we wnętrzu cząsteczki znajdującej się w środowisku wodnym i eksponowane na zewnątrz po zmianie środowiska n.i niepolarnc. Wielkocząsteczki różnią się zarówno ilością takich obszarów hydrofobowych, jak i ich umiejscowieniem w strukturze cząsteczki, co umożliwia ich rozdział ze względu na odmienne właściwości hydrofobowe. Dalej omówiono dwie główne techniki rozdziału makromolckuł ze względu na ich hydrofobowość. Obie wykorzystują hydrofobowe właściwości ligandów trwale umocowanych na powierzchni nośnika, a różnią się głównie składem fazy ruchomej przepływającej przez kolumnę. Pierwsza z nich, chromatografia oddziaływań hydrofobowych (hydrophobic interaction chro-matography — HIC), przebiega w środowisku wodnym, a odsłonięcie regionów hydrofobowych makromolekuły zachodzi dzięki zastosowaniu dużych stężeń soli. Druga z technik — chromatografia fazy odwróconej (reversed phasc chromato-graphy — RPC), wykorzystuje hydrofobowe właściwości rozpuszczalników organicznych. Różnica w używanych solwentach i eluentach ma istotne znaczenie ze względu na aktywność biologiczną rozdzielanych cząsteczek. Zastosowanie nicpolarnych rozpuszczalników organicznych w technice RPC prowadzi często do zniszczenia struktur III- i IV-rzędowych. Jest to szczególnie niekorzystne podczas prób izolowania aktywnych postaci enzymów czy receptorów. Do tych celów lepiej wybrać technikę HIC. gdzie izolowane makromolekuły znajdują się cały czas w środowisku wodnym i zachowują aktywność biologiczną. Natomiast w przypadku niewielkich cząsteczek, np. peptydów czy też hormonów, kontakt z niepolarnym środowiskiem rozpuszczalników organicznych nie powoduje istotnych zmian w strukturze przestrzennej i zdecydowanie lepszą metodą jest technika RPC, charakteryzująca się znacznie większą rozdzielczością niż HIC (patrz także: podrozdz. 10.2.8).

4.8.1. Podstawy teoretyczne chromatografii oddziaływań hydrofobowych

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) jest szeroko wykorzystywana do oczyszczania i wyodrębniania makromolekuł białkowych. Białka rozdziela się dzięki różnicy sił ich oddziaływań hydrofobowych z bardzo hydrofobowymi grupami ligandów, trwale umocowanych na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego. Różne czynniki wpływają na zachowanie się cząsteczek białkowych w kontakcie z hydrofobowym adsorbentem: niektóre z nich mają krytyczny wpływ na rozdzielczość i selektywność metody, a także zdolność wiązania się cząsteczek ze złożem. Dalej wymieniono i krótko omówiono najważniejsze czynniki: typ ligandu oraz jego gęstość na powierzchni nośnika, rodzaj nośnika, rodzaj i stężenie soli, pH, temperaturę i skład solwentów.

Typ ligandu unieruchomionego na nośniku (łańcuch alkilowy lub aromatyczne grupy arylowe) determinuje sposób adsorpcji cząsteczek białkowych. W szczególności liniowe łańcuchy alkilowe wykazują zdolność do czysto hydrofobowego oddziaływania, natomiast ligandy arylowe mają mieszane właściwości, tj. zarówno oddziałują przez liniowe fragmenty łańcucha, jak i wykorzystują wiązania typu n n

167

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
img111 3 Ćwiczenie 4.33. l/olowiinie białek surowicy wiążących jony motali (J. Porath i wsp 1975: Na
Laboratorium 3 BIAŁKA SUROWICY KRWI Ćwiczenie 1. Rozdział alektroforetyczny białek surowicy (rry/i p
Laboratorium 3 BIAŁKA SUROWICY KRWI Ćwiczenie 1: Rozdział elektroforetyczny białek surowicy Krwi na
img109 Ćwiczenie 4.29. Izolowanie enzymów /ulc/iiyt li ml NAI) i NADP* z za stosowa-niem złoża Bluc
PRACUJĘ Z SZEŚCIOLATKIEM ZESZYT ĆWICZEŃ (33) 37 Ćwiczenie 14
PRACUJĘ Z SZEŚCIOLATKIEM ZESZYT ĆWICZEŃ (33) 37 Ćwiczenie 14
W LITEROLANDII ĆWICZENIA 33 Mfy głos kuj. & inP U/ Hfodpisz obrazki. ŁUzupełnij.  &n
Ćwiczenie 12.Frakcjonowanie białek mleka i badanie ich właściwości1 Cel ćwiczenia Podczas ćwiczenia
kulturystyka059 ĆWICZENIE 33 Cel: Przydatne w dysc.: Pozycja wyjściowa: Ruch: Warianty ćwiczenia: ĆW
kulturystyka169 ĆWICZENIE 159 wariant ćwiczenia 33 Pozycja wyjściowa: Opad tułowia przodem do bloczk
m11 (3) 11/ fizycznych kolagenu i białek surowicy /złoto, penicylamina/, inne wykazują działanie
4 (11) KARTA nr 4 (rozdział 1., ćwiczenie 6.) 33
Ćwiczenie 1.Właściwości aminokwasów i białek Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie
ORTOFRAJDA MALOWANE DYKTANDA ZESZYT ĆWICZEŃ 33 Ten, kto pomalOje bez błędD, KrDlem Ortofrajdy zost

więcej podobnych podstron