img282
76 Dorota Hoja-Łukowicz
Redukcja kwasu fosfomolibdenowego zachodzi szybko w środowisku o pH 10, jednakże przy tym pH kwas fosforomolibdenowy jest nietrwały i ulega hydrolizie do kwasu fosforowego i molibdenowego. Dlatego po dodaniu odczynnika Folina badaną próbkę należy szybko i dokładnie wymieszać.
15.1.1.1. Materiały ,
Próbka - roztwór albuminy surowicy wolowej (BSA) o stężeniu w przedziale 10-100 pg/ml; roztwór wzorcowy białka (BSA) o stężeniu 1 mg/ml
15.1.1.2. Aparatura i sprzęt laboratoiyjny
Spektrofotometr (SPEKOL 221), probówki, statyw na probówki, pipety nastawne, czasomierz 15.1.1.5. Odczynniki
0.9% NaCl, IN NaOH, odczynnik węglanowy (1 ml 2% winianu sodowo-potasowego + 1 ml 2% CuS04 + 98 ml 2% Na2C05; przygotować bezpośrednio przed użyciem), odczynnik Folina-Ciocalteu (odczynnik powinien mieć barwę żółtą; powinien być przechowywany w ciemnej butelce i chroniony przed zanieczyszczeniami związkami organicznymi).
15.1.1.4. Wykonanie
Do 0.1 ml badanej próbki dodać 0.1 ml IN NaOH oraz 1 ml świeżo przygotowanego odczynnika węglanowego (mieszać w trakcie dodawania). Próbkę pozostawić na 15 minut. Następnie dodać 0.1 ml świeżo rozcieńczonego odczynnika Folina-Ciocalteu (rozcieńczać wodą destylowaną w stosunku 1:2; np.: 2 ml odczynnika Folina-Ciocalteu + 4 ml H,0). W trakcie dodawania odczynnika energicznie mieszać. Próbkę pozostawić na 30 minut w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Absorbancję odczytać wobec próby kontrolnej (0.1 ml 0.9% NaCl zamiast roztworu białka). Równolegle, posługując się roztworem wzorcowym, wykonać krzywą kalibracyjną, używając stężeń od 0 do 100 pg białka w 0.1 ml próbki.
Uwaga: Oznaczenie ilościowe białka wykonać w trzech równoległych powtórzeniach.
15.1.1.5. Opracowanie wyników
Na papierze milimetrowym wykreślić krzywą kalibracyjną (zależność absorbancji od stężenia białka) i wyznaczyć stężenie białka z trzech równoległych powtórzeń oraz obliczyć średnie stężenie białka w badanej próbce.
15.1.2. Oznaczanie stężenia białka .w próbce metodą Bradforda
Zasada: Wiązanie Coomassie Brillant.Blue£-250 do białka powodujejgntesunijciejnaksh rnum absorbancjjz 465 do 595 nm. Pojawiająca się barwa jest trwała od 2 minut do 1 godziny, przy czym optymalny czas pomiaru zawiera się między piątą a dwudziestą minutą po dodaniu odczynnika Bradforda. t-mVt
Zalety: Duża czułość metody oraz szybkie wykonanie oznaczenia. Metoda ta umożliwia oznaczenie białka już w stężeniu 0.4 pg/ml roztworu.
Wady: Poszczególne białka dają różne natężenie barwy z odczynnikiem Bradforda, należy więc stosować odpowiednie wzorce białkowe.
Aceton oraz detergenty, takie jak: siarczan dodecylu sodu (SDS) i Triton X-100, znacznie zwiększają natężenie barwy. Nieznaczne pogłębienie barwy powodują silne zasady.
15.1.2.1. Materiały
Próbka - roztwór białka (BSA) o stężeniu w przedziale 1-25 pg/ml
15.1.2.2. Aparatura i sprzęt laboratoryjny
Spektrofotometr (SPEKOL 221), probówki, statyw na probówki, pipety nastawne
15.1.2.3. Odczynniki
Roztwór wzorcowy (BSA) o stężeniu białka 1 mg/ml, odczynnik Bradforda (100 mg Coomas-sie Brillant Blue G-250 rozpuszczono w 50 ml 95% etanolu. Dodano 100 ml 85% kwasu ortofosforowego i dopełniono H20 dest. do 1000 ml), 0.15 M NaCl.
15.1.2.4. Wykonanie
100 pl roztworu wzorcowego rozcieńczyć H;0 dest. w stosunku 1:1 i pobrać do kolejnych probówek 0; 10; 20; 30; 40 i 50 pil, przy czym uzupełnić 0.15 M NaCl do objętości 50 pil. Do oddzielnej probówki pobrać 50 pl próbki o nieznanym stężeniu białka. Do wszystkich probówek dodać po 2.5 ml odczynnika Bradforda, wymieszać i po 5 minutach odczytać wartość absorbancji przy X = 595 nm wobec ślepej odczynnikowej.
Uwaga: Oznaczenia stężenia białka w badanej próbce wykonać w trzech równoległych powtórzeniach.
15.1.2.5. Opracowanie wyników
Na papierze milimetrowym wykreślić krzywą kalibracyjną (zależność absorbancji od stężenia białka) i wyznaczyć stężenie białka z trzech równoległych powtórzeń. Obi iczyć średnie stężenie białka w badanej próbce.
15.1.3. Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna
Spektrofotometria jest oparta na prawie Lamberta-Beera,.które wiąże pochłaniane promieniowanie z ilością (stężeniem) cząsteczek absorbujących i mówi, że równoległa wiązka promieniowania monochromatycznego ulega osłabieniu przy przejściu przez roztwór substancji absorbującej:
(O A = log(l0/l) = log(l/T) = kcl ,
gdzie: A- wartość absorpcji (absorbancja, ekstynkcja, gęstość optyczna) roztworu.
I„- natężenie pierwotnej wiązki światła,
I - jej natężenie po przejściu przez roztwór badany,
1 - grubość warstwy absorbującej, k - współczynnik absorpcji właściwej, c - stężenie roztworu,
T - przeźroczystość lub przepuszczalność (transmitancja) ośrodka.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
img285 82 Dorota Hoja-Łukowicz Chromatografię powinowactwa stosuje się do: - oczys
img286 84 Dorota Hoja-Łukowicz działu chromatograficznego rozpoczyna się zaraz po nałożeniu próbki.
img283 78 Dorota Hoja-Łukowicz .Współcżyhinikik j est wielkością charakterystyczną dla danej substan
img284 80 Dorota Hoja-Łukowicz Literatura Bradford M.M.: A rapid and sensitive method for the quanti
img283 78 Dorota Hoja-Łukowicz -Współczynnrkikjest wielkościącharakterystycznądla danej substancji
spokoju na 10-15 minut (zachodzi redukcja kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu askorbinowego siarkowo
61218 IMG69 (4) 76 Dorota Kius-Stanska. Marzenna Nowicka jakiejkolw iek argumentacji, która wyjaśni
img207 3 Redukcja tlenu cząsteczkowego przez NADH i FADH, z cyklu kwasu cytrynowego, zachodzi poprze
76 Dorota SosnowskaCHANGES OF (+)CATECHIN ANTIOXIDANT ACTIVITY DURINGENZYMATIC OXIDATION Summary The
skanuj0010 (91) Redukcyjne aminowanie a-oksokwasów O OH NH, , NaBH4 O J W roztworze kwasowym, czyli
s che 1H Miedź natomiast reaguje z kwasem azotowym^), ale jest to reakcja udenienift i redukcji. Rea
IMG?76 (2) wskazaniu pozostanie laki, jaki jest. Na podstawie znajomości konstrukcji miernika możemy
więcej podobnych podstron