Porównanie DNA roś i zwierz

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii

Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt

PORÓWNANIE ILOŚCI I JAKOŚCI DNA WYIZOLOWANEGO Z KOMÓRKI

ROŚLINNEJ I ZWIERZĘCEJ

METODY BADANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH:

U TECHNIKI MIKROSKOPOWE A. MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

Mikroskop elektronowy jest urządzeniem, którego zakres rozdzielczości wynosi 0,2-20 nm, co umożliwia oglądanie organelli komórkowych, wirusów i makrocząsteczek biologicznych (np. DNA), niemniej jednak ograniczeniem mikroskopu elektronowego jest brak możliwość oglądania próbek materii żywej.

Najbardziej popularną techniką uwidaczniania DNA jest metoda Klein-Schmidta. W tej technice kroplę roztworu DNA w octanie amonu zawierającym cytochrom c, nanosi się na powierzchnię octanu amonu. Po dotknięciu przez kroplę powierzchni, tworzy się na niej cienki film zdenturowanego cytochromu c. Film ten zawiera pewną ilość cząsteczek DNA, do której przyłącza się cienka warstwa cytochromu. Jeżeli do tego filmu zostanie przyłożony mały obiekt kulisty, to dołączy się do niego kropla zawierająca część filmu. Usunięcie fazy wodnej np. poprzez zanurzenie w alkoholu, spowoduje stabilne przyleganie warstwy do filmu pokrywającego kulisty obiekt. Technika ta zawiera wstępne barwienie pozytywne, np. octanem uranu. Metoda ta jest stosowana do określania długości i formy DNA. Zmodyfikowana metoda Klein-Schmidta pozwala natomiast zlokalizować specyficzne obszary w DNA m.in. określić pozycje końców liniowego DNA w formie kolistej, identyfikować bardzo długie cząsteczki izolowane z E.coli zainfekowanych fagiem X oraz określić kierunek replikacji DNA faga X.

B SKANINGOWA MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwala na badanie cech strukturalnych obiektów biologicznych o wymiarach 3-20 nm w buforach czy w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Znalazła ona zastosowanie w badaniach nad zginaniem DNA na skutek różnych oddziaływań z białkami, oddziaływaniem przeciwciał z różnymi formami DNA, w analizie relacji stechiometrycznych kompleksów białek z kwasami nukleinowymi i badaniach struktury chromatyny.

C. MIKROSKOPIA SKANINGOWO-TUNELOWA

Mikroskopia skaningowo-tunelowa jest precyzyjną techniką charakteryzującą się wysoką rozdzielczością - co najmniej 0,02x0,3 nm, pozwalająca uzyskiwać obraz trójwymiarowy. Za pomocą mikroskopu skaningowo-tunelowego bada się m.in. kompleksy białek z kwasami nukleinowymi oraz topografię DNA.

2. ELEKTROFOREZA