prep biomol skrypt1
Izolowanie białek wiążących jony metali
Większość cząsteczek białkowych w różnym stopniu oddziałuje z jonami metali. Siła tego oddziaływania uzależniona jest od struktury przestrzennej cząsteczki (domeny wiążące jony metali), od zawartości reszt aminokwasowych, które bezpośrednio mogą wiązać jony metali (histydyna, tryptofan i cysteina) oraz od pH otoczenia (optimum w przedziale 6-8),
Elucja specyficznie zaadsorbowanego materiału możliwa jest przez obniżenie pH i jednoczesne podwyższenie siły jonowej eluatu lub zastosowanie do elucji silnego chelatora jonów dwuwartościowych (EDTA)
U podstaw tego rodzaju chromatografii powinowactwa leży możliwość odwracalnego wiązania (chelatowania) jonów metali przez specjalnie przygotowany nośnik. Związane ze złożem jony metali (Zn, Cu, Cd, Hg, Co lub Ni) mogą z kolei specyficznie adsorbować peptydy i białka wykazujące z nimi powinowactwo. Należy spodziewać się, że w trakcie przepuszczania przez kolumnę związaniu ulegną te białka, które wykazują powinowactwo do jonów dwuwartościowych.
W wyniku zastosowania eluentu o narastającej sile jonowej i malejącej wartości pH, dojdzie do selektywnego wymywania tych cząsteczek, które w zmieniających się warunkach zmieniają swa konformację w ten sposób, że zmienia się ich ładunek powierzchniowy i zdolność wiązania jonów metali. Cząsteczki które zostały związane bardzo silnie z jonami i nie podlegały elucji w warunkach niskiego pH, mogą być usunięte z kolumny wraz z jonami przez zastosowanie silnego chelatora jakim jest EDTA.
Izolacja białek wiążących jony Zn2 z plazmy nasienia knura z zastosowaniem systemu chromatograficznego „BioPilot”
Przygotować bufory:
A) Bufor 0,05 MTris-HCI(pH 9,1)
B) Bufor 0,05 M Tris-octan (pH 8,0); 0,5 M NaCl
C) Jony Zn2+, w stężeniu 30 pM Zn27cm złoża, przy użyciu ZnCl
D) Bufor 0,05 M Tris-HCI (pH 7,0); 0,1 M imidazol
E) Bufor 0,05 M Tris-octan; 0,5 M NaCl; 0,05 M EDTA
Wykonanie:
1. Plazmę nasienia dializować wobec buforu A przez 24 godziny w temp. 4<5C. Po dializie
próbę odwirować przez 15 minut przy 10 000 x g w temp. pokojowej. Osad odrzucić, a supematant nanosić na kolumnę chromatograficzną
Rozdział przeprowadzić przy pomocy systemu chromatograficznego „BioPilot” wykorzystując złoże Chclating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences).
2. Na początku każdego rozdziału złoże zrównoważyć buforem B.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
prep biomol skrypt0 Ćwiczenie 3. ( hmmatografia powinowactwa białek plazmy nasienia knura wiążących
prep biomol skrypt 0 PRAKTYCZNA BIOCHEMIA BIAŁEK
prep biomol skrypt 2 Ćwiczenie 1. Metody chromatograficzne. Przygotowanie kolumny, złoża i buforów d
prep biomol skrypt 6 Wyznaczanie mas cząsteczkowych białek 1. Wykonać pomiar spekt
prep biomol skrypt 7 Ćwiczenie 2. Wstępne oczyszczanie białek różnymi technikami chromatograficznymi
prep biomol skrypt 1 SEPARACJA y-CLOBULIN Z SUROWICY KRWI Gamma - globuliny otrzymuje się na ogół pr
prep biomol skrypt 3 rozmiary ziarna żelu tym mniejsze są opory przepływu aJe tym gorsza jest też uz
prep biomol skrypt 4 Do określenia objętości rozpuszczalnika (eluentu) wypełniającego przestrzenie m
prep biomol skrypt 5 Wykonanie 1. Kolumnę zamocować pionowo w statywie. 2. &
prep biomol skrypt 8 Wykonanie: 1) Przemyć kolumnę 5 mi buforu A. Nie dopuścić do
prep biomol skrypt 9 Przed rozpoczęciem izolacji kolumnę należy ekwilibrować poprzez przepuszczenie
prep biomol skrypt2 3 Po zrównoważeniu złoże wysycić jonami Zn24. 4. Po naniesien
prep biomol skrypt3 Ćwiczenie 4 < li rafia fiydrufuhowa (HIC) i ml wróconej f
prep biomol skrypt4 b) Rozdział surowicy ki-wi na złożu Phenyl Sepharosc HP z wyk
prep biomol skrypt5 Ćwiczenie 5. Rnzd/inl ’k ji!a/m misicnin nu Tu(b
prep biomol skrypt6 Obecnie najbardziej rozpowszechnionym systemem SDS-PAGE jest układ wg Laemmli (
prep biomol skrypt7 Akrosyna (EC 3.4.21.10) to najbardziej aktywny enzym akrosomu plemnika. Wystypu
prep biomol skrypt8 Rozdział ełektroforetyczny plazmy nasienia na aktywność dysniutazy ponadtlenkow
więcej podobnych podstron