img283
78 Dorota Hoja-Łukowicz
-Współczynnrkikjest wielkościącharakterystycznądla danej substancji absorbującej, stałą dla danej długości fali i równą liczbowo wartości absorpcji roztworu o stężeniu jednostkowym i jednostkowej grubości warstwy.
Roztwory białek wykazują charakterystyczne maksimum absorpcji w zakresie UV przy długościach fali od.26.0 do,290,orn (zwykle odczytu absorbancji dokonuje się przy k = ^80 nijj) co wynika z obecności aminokwasów aromatycznych (Tyr, Trp, Phe). Umożliwia to oznaczenie stężenia białek w roztworach. W tym samym zakresie UV absorbują również inne związki, głównie kwasy nuklęinowe i nukleotydy. W roztworze białka położenie maksimum absorbancji UV zależy od pH roztworu białka oraz zawartości w nim reszt Tyr, Trp i Phe.
W zmodyfikowanej metodzie spektrofotometrycznej stężenie białka w próbce określa się na podstawie różnicy absorbancji mierzonych przy długościach fali 235 i 280 nm:
(2) stężenie białka (mg/ml) = (A235 - A2S0)/2.51
gdzie: współczynnik 2.51 jest różnicą pomiędzy średnią wartością współczynnika ekstynkcji (Eol%) w 235 i 280 nm.
Zalety: Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna umożliwia określenie stężenia białka w próbce bez korzystania z odnośnika białkowego i krzywej kalibracyjnej; eliminuje wkład kwasów nukleinowych w wartość mierzonej absorbancji (kwasy nukleinowe dają tę samą absorbancję przy 280 i 235 nm); jest niezależna od specyfiki składu aminokwasowego białka; pomiaru absorbancji przy wymienionych dwóch długościach fali można dokonać w tej samej próbce.
Wady: Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna wykazuje 45% czułości metody Low-ry’ego. Dla białek o specyficznym składzie aminokwasowym konieczne jest wykonanie krzywej kalibracyjnej.
15.1.3.1. Materiały
Próbka - 1 ml roztworu białka (BSA) o stężeniu w przedziale 1 - mg/ml
15.1.3.2. Aparatura i sprzęt laboratoryjny Spektrofotometr, kuweta kwarcowa o pojemności 1 ml
15.1.3.3. Wykonanie
Zmierzyć wartość absorbancji badanej próbki przy długościach fali 235 i 280 nm.
15.1.3.4. Opracowanie wyników
Korzystając ze wzoru (2), obliczyć stężenie białka w badanej próbce.
15.1.4. Określanie aktywności enzymatycznej białka
Według zaleceń Komisji Enzymatycznej z 1961 roku jednostką standardową enzymu ozna^ czoną symbolem J (ang.Stj) jest taka jego ilość, która katalizuję przemianę 1 mikromola sujr-stratujlub 1 mikromola odpowiednich grup chemicznych) w .ciągu J minuty w warunkach optymalnych (w środowisku o stężeniu jonów wodorowych, w którym enzym wykazuje maksymalną aktywność i w pbecności.wszystkich potrzebnych kofaktorów,w odpowiednich stężę-niach) przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu i w temperaturze 30°C_ (miano:;jpmoVmftjj). Stopień czystości preparatów enzymatycznych określa aktywność właściwa, tzn. liczba jednostek standardowych przypadająca na 1 mg białka (J/mg). Dla maksymalnie oczyszczonych homogenicznych preparatów można wyznaczyć aktywność molekularną, tj. liczbę cząsteczek substratu przekształconych w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu w warunkach optymalnych. Wielkość tę można wyrazić liczbą jednostek standardowych przy-padającąna 1 mikromol enzymu (J/pmol). Posiada ona miano 1/min (ponieważ J wyraża się w pmol/min).
Według zmian Komisji Enzymowej Międzynarodowej Unii Biochemicznej z 1972 roku, jednostką enzymatycznąjest ta aktywność enzymu, która przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 sekundy. Jednostkę tę nazwano kkaleril-;(kąt); jej mianem jest mol/s, a pochodnymi sąmi-krokatal (10 ć kat) i nanokatal (10“9 kat). Aktywność właściwą wyraża się w mikrokatalach na kilogram białka (pkat/kg). Zależność liczbowa między starymi i nowymi jednostkami jest następująca:
lkat = 1 mol/s = 6 • 107 J 1 J = 1 pmol/min = 16 • 67 ■ 10 9 kat
15.1.4.1. Materiały
Frakcja lizosomowa wątroby 3-miesięcznych szczurów
15.1.4.2. Aparatura i sprzęt laboratoryjny
Spektrofotometr (SPEKOL 221), probówki, statyw na probówki, łaźnia wodna, czasomierz, pipety nastawne
15.1.4.3. Odczynniki
Bufor octanowy (0.3 M CHjCOONa/CHjCOOH pH 4.5), substrat (3 mM p-D-glukuronid fenoloftaleiny), stoper (0.5 M glicyna-NaOH pH 10.4)
15.1.4.4. Wykonanie
Przygotować 10-, 50- i 100-krotne rozcieńczenia frakcji lizosomowej wątroby szczura. Z każdego rozcieńczenia odpipetować do oddzielnych probówek po 30 pi każdej próbki, dodać 100 pl buforu octanowego pH 4.5 i 30 pl substratu. Inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut. Reakcję enzymatyczną zatrzymać, dodając 0.8 ml stopera. Stężenie przekształconego substratu mierzyć w specolu przy X = 555nm i k = 884 wobec ślepej odczynnikowej. Odczyt ten jest wyrażony w nmol/ml. Po uwzględnieniu czasu inkubacji i przeliczeniu go na 1 s otrzymujemy nkatale.
Uwaga: Oznaczenia aktywności P-glukuronidazy wykonać w 2 równoległych powtórzeniach.
15.1.4.5. Opracowanie wyników Obliczyć aktywność enzymu w nkat.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
img283 78 Dorota Hoja-Łukowicz .Współcżyhinikik j est wielkością charakterystyczną dla danej substan
img285 82 Dorota Hoja-Łukowicz Chromatografię powinowactwa stosuje się do: - oczys
img286 84 Dorota Hoja-Łukowicz działu chromatograficznego rozpoczyna się zaraz po nałożeniu próbki.
img282 76 Dorota Hoja-Łukowicz Redukcja kwasu fosfomolibdenowego zachodzi szybko w środowisku o pH 1
img284 80 Dorota Hoja-Łukowicz Literatura Bradford M.M.: A rapid and sensitive method for the quanti
skanuj0001 gdzie: c - molowy współczynnik absorpcji [wielkość charakterystyczna dla danej substancji
Skrypt PKM 225 256 Współczynnik wielkości kół dla układu odniesienia h » 30 i nu, 1 3 Współczynnik
spektroskopia039 78 Rys. 42. Zależność współczynnika odbicia od energii fotonów dla fosforku cynku —
IMG70 (4) 78 Dorota Klus-Stańska, Marzennu Nowicka się ocen. Obie te grupy ocen ogólnych odbiegają
wspó czynnik wielko ci przekroju .Rys. , Współczynnik wielkości przekroju e i e, elementów ze stali
052 2 wymiar O (1.5.5.7)i, mm Rys. 1.5.4.38. Współczynnik wielkości przedmiotu £ dla elementów stalo
biotermo5 2. Potencjał chemiczny - jest to wielkość charakterystyczna dla danej substancji, określa
więcej podobnych podstron