img109
Ćwiczenie 4.29. Izolowanie enzymów /ulc/iiyt li ml NAI)' i NADP* z za stosowa-niem złoża Bluc Sepharose (G.E. Lamkin, I I Kinu 1976: Biochem. Biophys. Ren Commun.y 72:560 565)
Zasada: Związany z żelem Sepharose CL-6B barwnik Cibacron Bluc F3G-A wykazuje duże powinowactwo do wielu enzymów i białek, w tym do enzymów zależnych od NADł i NADPf, do albumin, czynników krzepnięcia krwi, a także do interferonu. Stosując złoże Blue Sepharose CL-6B można z łatwością oczyścić U białka. W tym ćwiczeniu zostanie to zilustrowane przykładem metody wyodręb niania dehydrogenaz z ekstraktu komórek drożdży.
Materiał: Ekstrakt białek uzyskany z drożdży piekarniczych w wyniku lizy komórek drożdży w 0,1% roztworze Tritonu X-I00.
Odczynniki:
1) Bluc Sepharose CL-6B.
2) Bufor: 0,02 M Tris/HCI - 5 mM MgCl2 - 0,4 mM EGTA - 2 pM 2-merkaptoctanol (pH 6,4).
3) Bufor: 0,02 M Tris/HCI - 5 mM MgCI2 - 0.4 mM EGTA - 2 pM 2-merkaptoctanol (pH 8.6).
4) 5 mM roztwór NAD' w 0,02 M buforze Tris/HCI (pH 6,4).
5) 10 mM roztwór NAD' w 0,02 M buforze Tris/HCI (pH 6.4).
6) 10 mM roztwór NADP* w 0.02 M buforze Tris/HCI (pH 6,4).
7) 20% roztwór etanolu.
Wykonanie: Odważyć 3 g suchego złoża Bluc Sepharose CL-6B i zamoczyć jc w 20 ml 0,02 M buforu Tris/HCI o pH 6,4. Po około 30 minutach przemyć złoże 3-krotnie tym buforem, porcjami po 20 ml. Tak zrównoważone złoże (około 10 ml) upakować w plastikowej kolumnie. Ekstrakt białek drożdży rozcieńczyć buforem Tris/HCI o pH 6,4 do stężenia 10 mg/ml, odwirować (5000 xg przez 15 min) i nanieść 20 ml tak przygotowanego ekstraktu na kolumnę. Używając tego samego buforu (100 ml), odmyć białka niespecyficznie zaadsorbowane na złożu. Swoiście związane białka cluować za pomocą 5 mM roztworu NAD* (30 ml). Zbierać 2-mililitrowe frakcje. W następnych etapach kolumnę przemyć buforem Tris/HCI
0 pH 6,4 (20 ml), a kolejne białka związane swoiście eluować kolejno 10 mM roztworem NADP ’ (30 ml), buforem Tris/HCI o pH 8,6 (30 ml), a w końcu 10 mM roztworem NAD* (30 ml), cały czas zbierając materiał wypływający z kolumny. Po zakończeniu elucji kolumnę przemyć buforem Tris/HCI o pH 6,4 (100 ml), wodą (100 ml) i 20% etanolem (30 ml). Kolumnę przechowywać w temp. 4°C do ponownego użycia. W zebranych frakcjach oznaczyć spektrofotometrycznic (A = 280 nm) stężenie białka.
W pierwszym szczycie białkowym, wymywanym przez 5 mM roztwór NAD', znajduje się dehydrogenaza alkoholowa (EC 1.1.1.71). W drugim, wymytym za pomocą 10 mM roztworu NADP + , występuje dehydrogenaza glukozo-6-fosforano-wa (EC 1.1.1.49). W kolejnym szczycie chromatograficznym, po elucji bardziej zasadowym buforem Tris/HCI (pH 8,6), znajduje się heksokinaza (EC 2.7.1 I)
1 w ostatnim 10 mM NAD' eluuje dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (EC 1.2.1.12). Końcową identyfikację wyizolowanych enzymów można przeprowa dzić stosując testy enzymatyczne.
Ćwiczenie 4.30. Oczyszczanie 111RNA z zastosowaniem /ln/a /-uwierającego |H>li(U)
(J.M. Taylor i wsp. 1976: ./. Biol. Chem., 251:7461 7467)
Zasada: Złoże Poly(U)-Sepharose 4B jest adsorbentem, który specyficznie i w sposób odwracalny wiąże kwasy nukleinowe pochodzenia roślinnego oraz mRNA. Złoże przygotowuje się przez związanie długich łańcuchów kwasu poliurydylowego (ok. 100 podjednostek) z żelem Sepharose 4B. Prawie wszystkie cząsteczki mRNA mają w swej strukturze sekwencję kwasu poliadenylowego [poli(A)], komplementarną do sekwencji poli(U). Dzięki temu, wykorzystując komplcmentarność obu zasad, / łatwością można wyizolować cząsteczki mRNA w drodze chromatografii powinowactwa.
Materiał: Odwodniony preparat całkowitego RNA.
Odczynnik b
1) Poly(U)-Scpharose 4B.
2) Destylowana H20, w której rozpuszczono DEPC (0.1%) (diethylpyrocarbonatc dictylopirowę-glan) i następnie autoklawowano.
3) 0.1 M roztwór NaCI.
4) Bufor ekstrakcyjny: 50 mM Tris/HCI - 1% N-lauroilosarkozyna - 30 mM EDTA (pH 7,5).
5) Bufor startowy: 25% roztwór formamidu w układzie: 50 mM Tris/HCI - 0.7 M NaCI - 10 mM EDTA (pH 7,5).
6) Bufor do elucji: 90% roztwór formamidu w układzie: 10 mM K,HPOA - 10 mM EDTA - 0.2% A'-lauroilosarkozyna (pH 7,5).
Wykonanie: Destylowaną H20 poddać działaniu DEPC (0,1%) przez 12 godz., a następnie autoklawować. Wszystkie bufory muszą być sporządzone z tak przygotowanej wody. Odważyć 1 g żelu Poly(U)-Sepharose 4B, nanieść na filtr szklany i przemyć 0,1 M roztworem NaCI (100 ml), a następnie upakować szklaną kolumnę (5 10 ml), uprzednio autoklawowaną. Przemyć kolumnę buforem startowym (100 ml). Próbkę RNA (ok. 1 3 mg) rozpuścić w buforze ekstrakcyjnym, podgrzać do 65°C i utrzymywać w tej temperaturze przez 5 min, a następnie szybko schłodzić na lodzie i rozcieńczyć 5-krotnie buforem startowym. Tak przygotowaną próbkę przepuścić przez kolumnę z żelem Poly(U)-Sepharose 4B. Kolumnę przemyć buforem startowym (100 ml) w celu usunięcia niespecyficznie zaadsorbowanych cząsteczek. Cząsteczki mRNA, umocowane wiązaniami wodorowymi, można wymyć buforem do elucji (20 ml), zawierającym dużą ilość (90%) formamidu, i zbierać 1-mililitrowe eluaty. Frakcje zawierające mRNA zidentyfikować spektrofotomet-rycznie (ż = 254 nm), pamiętając o tym, aby jako próbę referencyjną zastosować bufor do elucji. Kolumnę przemyć ponownie buforem do elucji (100 ml), a następnie buforem startowym (100 ml) i przechowywać w temp. 4°C do 4 tygodni.
Ćwiczenie 4.31. Zastosowanie złoża Poly(A)-Sepharose 4B do oczyszczania białek wiążących mRNA z cytosolu komórek wątroby szczura (A. Schweiger, G. Mazur 1976: Z. Physiol. Chem. Hoppe Seylers, 357:481 485)
Zasada: Żel Poly(A)-Sepharose 4B jest adsorbentem mogącym specyficznie i odwracalnie wiązać cząsteczki komplementarne, m.in. białka wiążące się z mRNA, poprzez sekwencję poliadenylową.
163
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
img109 3 Ćwiczenie 4.29. Izolowanie enzymów zulc/iiyili ml NAD i NADP z zastosown niem złoża Hlue Se
Zestaw 7 e 4. Oblicz wysokość kątową Słońca md horyzontem dla 29.12.2007 roku godz li czasu słonecz
Zeszyt Cwiczeń FUNKCJI POZNAWCZYCH 1 (35) ĆWICZENIE 29 Zaznacz wskazówkami na zegarze godzinę: 35
skanuj0025 (192) 38 Mathcad. ĆwiczeniaRysunek 3.29. Obliczenie kosinusów kierunkowych sieczny
skanuj0160 i l Ćwiczenie 29*Wyznaczanie prędkości dźwięku w powietrzu I. Wprowadzenie 1.1. Fale
metody pracy z grupą w poradnictwie zawodowym strona2 153 ĆWICZENIE 29 ZAMIANA CELU ŹRÓDŁO Opracowa
mikroekonomia ćwiczenia (29) * o " ■ - kV Zad.2 Usługi optyczne (podaż i wielkość podaży) Niże
10 pazdziernik 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 f
img043 (4) 18Ćwiczenie 28 Wklej kolorowy obrazek i opowiedz, co na nim widzisz.Ćwiczenie 29„ Zaprosz
W LITEROLANDII ĆWICZENIA 29 ■podpisz obrazki. ■? *~s?Ha &
więcej podobnych podstron