CCF20091118004

Biologia nowotworzenia - Ćwiczenie 5 i 6

Barwienie preparatów parafinowych czerwienią syriuszową [Junąueira i wsp., 1979; Kesler i wsp., 2000]

1. Preparaty parafinowe barwić w roztworze czerwieni Syriusza - 1 godzina.

2. Preparaty płukać w 1% kwasie octowym- 30 minut.

3. Preparaty płukać w wodzie destylowanej -3x10 sekund.

4. Odwodnić preparaty w alkoholu etylowym:

* I alkohol 99,80% - kilka sekund,

* II alkohol 99,80% - kilka sekund.

5. Przesycić preparaty w czystym acetonie - kilka sekund.

6. Preparaty płukać w czystym ksylenie:

* I ksylen - kilka sekund,

* II ksylen - kilka sekund.

3.2. Rejestracja i analiza obrazów preparatów parafinowych barwionych czerwienią syriuszową zmian skórnych w świetle spolaryzowanym

Do rejestracji obrazów i analizie zawartości kolagenu w preparatach parafinowych zmian barwnikowych skóry służy zestaw aparatury, w skład którego wchodzi:

mikroskop świetlny BX41 (Olympus Optical Co. Ltd) z filtrami polaryzującymi -

analizatorem i polaryzatorem,

kamera CCD - DP50 (Olympus Optical Co. Ltd),

komputer NCM Intel Camino 733, P-III-733,

- program komputerowy do rejestracji i analizy - analySIS (Soft Imaging System).

3.1. Procedura rejestracji i analizy obrazów preparatów parafinowych barwionych czerwienią syriuszową zmian skórnych w świetle spolaryzowanym

1. Uruchomić komputer.

2. Uruchomić program analySIS {Soft Imaging System).

3. Przystawkę z mniejszym filtrem, tzw. analizatorem, należy umieścić w okolicach tubusa mikroskopu.

4. Większy filtr, tzw. polaryzator należy umieścić tuż nad źródłem światła, czyli pod stolikiem mikroskopu.

5. Preparaty parafinowe odparafinowane i wybarwione czerwienią syriuszową umieścić na stoliku mikroskopu.

6. Ustawić polaryzator na 90°.

7. Ustawić obiektyw 10x.

8. Wybrać odpowiedni obszar preparatu do rejestracji obrazu (powinien to być brzeg zmiany, centrum i skóra zdrowa otaczająca zmianę).

9. Zarejestrować obraz.

Aby obraz został prawidłowo zarejestrowany, należy dobrać taki czas rejestracji, przy którym obraz nie byłby zbyt ciemny, ale także nie prześwietlony. Przed przystąpieniem do właściwego zarejestrowania obrazów każdy z nich musi zostać sprawdzony pod kątem ewentualnego niedoświetłenia lub prześwietlenia.

3.1.1. Procedura określenia optymalnego czasu naświetlania obrazu

1. Zarejestrować obraz w świetle spolaryzowanym (polaryzator ustawiony na 90°) przy wybranym czasie (obraz nr 1).