29
czeniu z białkiem niebieskofioletowe. Intensywność zabarwienia kompleksu białko -barwnik mierzy się przy długości fali 620 nm bezpośrednio po wykonaniu reakcji.
Metoda_ biuretowa. Zasada metody oparta jest na tworzeniu przez białka i peptydy (zawierające co najmniej dwa wiązania peptydowe) w środowisku zasadowym barwnych kompleksów z jonami miedziowymi (patrz ćwicz. 1). Metoda ta obecnie jest mało stosowana ze względu na niską czułość — można oznaczyć zawartość białka w' próbie od 100 pg. Inną wradą metody jest jej nieprzydatność przy oznaczaniu białka w obecności soli amonowych, gdyż^jcm amonowy tworzy’ barwne kompleksy z jonami miedzLggę^
^/Mćtodn. I.nwryegoiws^pracowników. Bardzo popu 1 am ytfT^posOnem oznaczania ilość: białka jest metoda LowTy’ego i współpracowników, która stanowi temat ćwiczenia. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz obecność dwóch aminokwasów aromatycznych — tyrozyny i tryptofanu oraz jednego siarkowego cysteiny. Reakga biuretowa (tworzenie kompleksów przez wiązania peptydowe i jony miedziowe) jest wzmocniona w tej metodzie inną reakcją z odczynnikiem Folina i Ciocalteu, w' której kwas fcsforomolibdenowy i fosforowrolframowy ulega redukcji do błękitu fosforomolibdenowego z udziałem, tyrozyny, tryptofanu j cysteiny. Stężenie barwnego (fioletowego) kompleksu można mierzyć kolorymetrycznie w zakresie widma widzialnego długości 600-700 nm .^Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje jię z kizywnj__wzorcow'ej. Przy tym dla uzyskania wiaściwych wyników’ niezmiernie ważny jest dobór białka wzorcowego do sporządzania tej krzywej. Powinno ono zawierać w cząsteczce ilość tyrozyny, tryptofanu i cysteiny możliwie zbliżoną do badanego białka.
Zaletą metody jest znaczna jej czułość, można bowiem oznaczyć ilość białka już od 1 pg w’ próbie, a zależność proporcjonalną między intensywnością zabarwienia roztworu a stężeniem białka obserwuje się nawet przy większych stężeniach — do 200 pg. Wadą metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w stosunku do białka oznaczanego. Inna wradą jest zawyżanie wyników' oznaczania w wyciągach nie dializowanych z powodu.redukcji odczynnika Folina przez wolne aminokwasy i niewielkie peptydy. Poza tym metoda jest mało przydatna w bezpośrednim oznaczaniu zawartości białka w preparatyce enzymatycznej, w której stosowane są związki ochronne, np. EDTA (kwas dwuwersenowy) ditiotreitol, cysteina itd., a które mogą również redukować odczynnik Folina.
Odczynniki
1. Odczynnik miedziowy: a) 2-proc. roztwór węglanu sodow-ego w 0,1-molowym wodorotlenku sodowym, b) 2-proc. wodny roztwór winianu sodowo-potasow'ego, c) 1-proc. wodny roztwór CuSo4 • 5 H20; przed użyciem w' cylindrze miarowym na 100 ml zmieszać 98 ml roztworu a) z 1 ml roztworu b) i 1 ml roztworu c\
2. Odczynnik Folina — wykonanie patrz. str. 131 5“
3. Wzorcowe roztwory albuminy o stężeniach 20, 40, 8$. 140 i 200 pg/mi.
4) Rozcieńczony roztwór mleka krowiego: 10 ml mleka przegotowanego rozcieńczyć do 1 1, do kolb miarowych na 50 ml wydawać od 2 do 8 ml.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
skanuj0009 powoduje intensywne zabarwienie już istniejącego, lekko zabarwionego barwnika. Rumień poś
CCF20091008 106 zaadsorbowania barwnika, rozdział barwnika między roztworem a minerałem, intensywnoś
IMGd48 Proteasomy trawiąniepotrzebne lub obce białka • to duże kompleksy białkowe - w części central
ksi ¬ki studia 3 250 Rozdział 17 o różnej wielkości i intensywności zabarwienia. Ułatwia on opis i k
cykl?lvina 1 Rys. 5.19. Rozmieszczanie głównych kompleksów białkowych w błonach tylakoidów gran i st
DSC00047 (12) Hemoglobina jest białkowym barwnikiem krwi, głównym składnikiem wypełniającym krwinkę
SNV39266 M,BI»na biologiczna . inaczej biomembrana. kompleks białkowo-lipidow będący jedną z podstaw
Skan4 bmp 1.3. Oznaczanie witaminy C (bezpośrednia redukcyjność) w próbkach intensywnie zabarwionyc
IMG 39 prątki zabarwione na gorąco barwnikami anilinowymi nie odbarwiają się pod wpływem k
C16 (5) v/umzeme wodochłonności spowodowane jest zakwaszeniem środo- M wiska (pH = 5,4). Wytworzony
1195281898543646829550?30457215504179366 o Żółtaczka fizjologiczna Żółte zabarwienie skóry i białkó
więcej podobnych podstron