8

FARMAKOPEA POLSKA WYD. VII TOM I

2.6.14. ENDOTOKSYNY BAKTERYJNE

Przed użyciem, ogrzewać podłoże 5 min w łaźni wodnej i ochłodzić. Do każdej probówki dodać 0,5 ml roztworu pi-rosiarczynu sodu OD (12 g/1) i 0,5 ml roztworu cytrynianu żelaza(III)-amonowego (10 g/1). Oba roztwory powinny być przygotowane bezpośrednio przed użyciem i przesączone przez sączek membranowy (wielkość porów: 0,45 pm).

Agarowe podłoże S (R2A)

Wyciąg drożdżowy 0,5 g

Pepton proteose 0,5 g

Hydrolizat kazeiny 0,5 g

Glukoza 0,5 g

Skrobia 0,5 g

Dipotasu wodorofosforan 0,3 g

Magnezu siarczan bezwodny 0,024 g

Sodu pirogronian 0,3 g

Agar 15,0 g

Woda oczyszczona 1000 ml

Doprowadzić pH, aby po sterylizacji wynosiło 7,2 ± 0,2. Wyjaławiać 15 min w sterylizatorze parowym w temp. 121°C.

CZYNNIKI NEUTRALIZUJĄCE

Czynniki neutralizujące mogą być stosowane do neutralizacji aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Neutralizatory mogą być dodawane, najlepiej przed sterylizacją do zbuforowanego roztworu chlorku sodu z peptonem o pH 7,0. Jeżeli są stosowane, należy wykazać ich skuteczność neutralizacji oraz brak działania toksycznego w stosunku do drobnoustrojów.

Typowy roztwór neutralizujący ma następujący skład:

Polisorbat 80 30 g

Lecytyna (z jaja) 3g

Histydyny chlorowodorek 1 g

Pepton (mięsny lub kazeinowy) ’ lg

Sodu chlorek 4,3 g

Potasu diwodorofosforan 3,6 g

Disodu wodorofosforan dwuwodny 7,2 g

Woda oczyszczona 1000 ml

■Wyjaławiać 15 min w sterylizatorze parowym w temp. 121°C.

Jeżeli roztwór wykazuje niedostateczne właściwości neutralizujące, można zwiększyć stężenie polisorbatu 80 lub lecytyny.

Zamiennie, można stosować neutralizatory zamieszczone w tabeli 2.6.13.-3.

01/2005:20614

2.6.14. ENDOTOKSYNY BAKTERYJNE

Badanie obecności endotoksyn bakteryjnych (test LAL) jest wykonywane w celu wykrycia lub oznaczenia zawartości endotoksyn bakterii Gram-ujemnych, z zastosowaniem lizatu amebocytów skrzypłocza (Limulus polyphemus lub Tachypleus tridentatus). Wyróżnia się trzy techniki badania: żelową polegającą na utworzeniu żelu; zmętnieniową (turbidymetryczną), polegającą na wywołaniu zmętnienia w wyniku rozszczepienia endogennego substratu oraz chromogenną polegającą na powstaniu zabarwienia w wyniku enzymatycznego rozszczepienia syntetycznego kompleksu peptyd-chromogen.

W rozdziale opisano 6 następujących metod:

Metoda A. Metoda żelowa: badanie graniczne

Metoda B. Metoda żelowa: badanie półilościowe

Metoda C. Zmętnieniową (turbidymetryczną) metoda kinetyczna

Metoda D. Chromogenną metoda kinetyczna

Metoda E. Chromogenną metoda pomiaru punktu końcowego

Metoda F. Zmętnieniową metoda pomiaru punktu końcowego

Oznaczenia można przeprowadzać każdą z wyżej wymienionych 6 metod. Jeżeli wyniki otrzymane po wykonaniu badań jedną z tych metod są wątpliwe lub sporne, to znaczenie rozstrzygające mają wyniki uzyskane metodą A, jeżeli nie podano inaczej w monografii.

Badania wykonywać w warunkach zabezpieczających próbki i sprzęt przed zanieczyszczeniem endotoksynami.

Aparatura

Pozbawić endotoksyn szkło i inny sprzęt odporny na ogrzewanie przez umieszczenie w suszarce używając zwalidowa-nego procesu. Powszechnie stosowany jest czas co najmniej 30 min i temp. 250°C. Jeżeli używana jest aparatura z tworzywa sztucznego, np. płytki mikrotitracyjne czy końcówki do pipet automatycznych, to musi ona być sprawdzona na nieobecność endotoksyn i czynników zakłócających test, tzw. czynników interferujących.

UWAGA: W monografii termin „probówki" odnosi się do wszystkich naczyń używanych w badaniu, np. dołków płytek mikrotitracyjnych.

Przygotowanie roztworu podstawowego endotoksyny wzorcowej

Roztwór podstawowy endotoksyny wzorcowej jest sporządzany z porównawczej endotoksyny wzorcowej mianowanej wobec Międzynarodowego Wzorca, np. endotoksyny wzorcowej BPP.

Tabela 2.6.13.-3. Substancje neutralizujące czynniki przeciwdrobnoustrojowe dodawane do zbuforowanego roztworu

chlorku sodu z peptonem o pH 7,0

Rodzaj czynnika przeciwdrobnoustrojowego	Substancja neutralizująca	Stężenie	Uwagi
Związki fenolowe	Sodu laurylosiarczan Polisorbat 80 i lecytyna Żółtko jaja	4 g/1 30 g/1 i 3 g/1 5 ml/1 - 50 ml/1	Dodać do jałowego zbuforowanego roztworu chlorku sodu z peptonem o pH 7,0
Organiczne związki rtęci	Sodu tioglikolan	0,5 g/1 - 5 g/1
Związki halogenowe	Sodu tiosiarczan	5 g/1
Czwartorzędowe związki amoniowe	Żółtko jaja	5 ml/1 - 50 ml/1	Dodać do jałowego zbuforowanego roztworu chlorku sodu z peptonem o pH 7,0

Wskazówki ogólne” (1) odnoszą się do wszystkich monografii i innych tekstów

261