84760
Teraz chciałem pokazać państwu jak używa się genu reporterowego. Jeden z wielu przykładów to test CAT assay, często używany w biologii molekularnej do badania aktywności komórkowej. Test, w którym wykorzystuje się acetylotransferazę chloramfenikolu.
Tu się przygotować na masło maślane!
Na początku jest plazmid, w którym mamy gen x - gen, którego promotor chcemy zbadać. W tych wszystkich testach analizujemy funkcję promotora. I aby układ dostosować do układu testu z genem reporterowym, X jest usuwany, np. przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Na jego miejsce wstawiany jest gen cat. Promotor zostaje. Ten układ jest trochę wydumany, dlatego że zwykle to akurat na odwrót się robi. Tzn. dysponujemy wektorem, w którym jest promotor podstawowy, pod którego kontrolą jest gen cat. I tu byłby cat i jakiś promotor podstawowy. Do tego dokładamy region promotora, który chcemy badać. Można też oczywiście usunąć ten podstawowy promotor i cały promotor umieścić przed genem cat, tak że dostaniemy taki rekombinowany konstrukt - promotor, a pod jego kontrolą gen cat. Teraz ten konstrukt transformuje komórki eukariotyczne. Cat bowiem jest bakteryjny, nie ma jego odpowiednika w komórkach eukariotycznych. Następnie komórki są jakiś czas utrzymywane w warunkach hodowli, po to żeby w komórkach nagromadził się produkt ekspresji cat, czyli acetyłotransferaza chloramfenikolu. Trwa to kilkanaście godzin, żeby enzym pojawił się w komórce.
Musimy w dalszej części eksperymentu sprawdzać czy faktycznie aktywność cat jest obecna w komórkach Przygotowuje się zatem ekstrakt komórkowy, który jest inkubowanyz substratami. Substratem jest chloramfenikol, antybiotyk, naturalny substrat acetylotransferazy chloramfenikolu, oraz acetyloCoA.Te 2 związki dodawane są do ekstraktu. Chloramfenikol jest znakowany radioaktywnie UC. Całość inkubowana. Analizujemy skutek reakcji, czyli czy chloramfenikolu uległ acetylacji (przez cat). Najprostszy sposób analizy to chromatografia cienkowarstwowa. Na rys. widać, że naniesiono na płytkę 3 próbki. Ponieważ substrat jest radioaktywny, to po rozwinięciu
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Mikołaj właśnie chciał pokazać Julce, jak się jedzie bez trzymanki z nogami na kierownicy, kiedy&nbs
P1360886 f 66 SZTUKA AKTORSKA XX WIEKU Wybrał mocno zbudowanego studert-ta, pokazał mu, jak utrzymać
31 .Jak nazywa się najmniejszy ssak żyjący w Polsce? Jest to ryjówka malutka. Podobna wyglądem do my
HPIM4453 170 Hanna Świda-Zicmbą Nie wiem jak zachowałbym się w rej sytuacji. W dużej mierze zależało
skanuj0001 (621) 7. TURYSTYKA JAKO ZJAWISKO GOSPODARCZE Turystyka, jak powszechnie się uważa, stanow
Rodzaje kabli Do budowy sieci lokalnych używa się różnych odmian przewodów. Najczęściej są to skrętk
ODSZYFRUJ(1) Jak nazywa się przedstawiona figura? Masz radę, jest to Utwórz z tego słowa co naj
38 39 (8) lub celu tego badania, obok nazwy „metoda naukowa”, używa się też nazwy „technika naukowa”
70 71 (26) kowskiego z 1912 r., iż mlodokaszubi uznają się za szczep jeden z wielu wielkiego narodu
Image019a B. Uśmiechnij się szeroko, ale nie pokazy zębów. Teraz wysuń wargido przodu.jak
Wśród rozmaitych zagadnień, jakie pojawiają się przy okazji naszej sprawy, chciałbym wyróżnić jedno:
Slajd10 A teraz trochę statystyki - jak rozwijała się współpraca AA z Zakładami Karnymi i Aresztami
więcej podobnych podstron