1250463197

Biochemia: Ćw. 11 - Metoda RT-PCR

4. Elektroforeza agarozowa produktów reakcji PCR

Produkt reakcji PCR identyfikujemy rozdzielając uzyskany materia! w żelu agarozowym metodą elektroforezy. W celu określenia wielkości badanego genu równocześnie rozdzielmy w żelu standardy masowe - fragmenty DNA o znanej wielkości wyrażonej w ilości par zasad (pz, ang. base pair, bp). Na podstawie położenia badanego genu w stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość. Rozdzielone elektroforetycznie produkty reakcji PCF wizualizujemy przy użyciu fiuorochromu bromku etydyny (EtBr), który interkalując z dsDNA (dwuniciowym kwasem deoksyrybonukleinowym, ang. double stranded deoxyribonucleic acidj wykazuje intensywną fluorescencję w świetle UV.

Wykonanie

Przygotowanie 2% żelu agarozowego

Do kolby stożkowej o poj. 250 ml dodać 0.8 g agarozy oraz 40 ml buforu TAE (40mM Tris-kwas octowy, pH 8.3,1mM EDTA). Dokładnie rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce przez 3-5 min. Zamieszać zawartość kolby; jeśli agaroza nie uległa rozpuszczeniu kolbę umieścić ponownie na kilka minut w mikrofalówce. Złożyć podstawę na żel z płytkami zamykającymi oraz grzebieniem do formowania studzienek. Do roztworu agarozy schłodzonego pod wodą bieżącą do temp. 50 - 60°C dodać 2.5 pl bromku etydyny (uwaga! bromek etydyny ma cfciałanie karcynogennel). Dokładnie wymieszać a następnie wylać żel na podstawę i odczekać do zastygnięcia (30 - 40 min, RT). Wyjąć płytki zamykające podstawę z żelem oraz grzebień. Umieścić żel w aparacie horyzontalnym (poziomym) wypełnionym buforem TAE (ok. 300 ml).

Przygotowanie próbek

Do sterylnej probówki typu eppendorf o poj. 0.5 ml używając sterylnych końcówek dodać:

5 pl cDNA (amplifikatu uzyskanego w reakcji PCR),

1 pi buforu do próbek 6-krotnie stężonego (Loading Dye Solution, Fermentas).

Wymieszać i krótko żwirować.

Rozdział elektroforetyczny

Próbki nałożyć do studzienek (kieszonek) wykonanych w żelu grzebieniem. Podłączyć elektrody do zasilacza i prowadzić rozdział przez 30 min przy napięciu 100 V. Pod wpływem pola elektrycznego ujemnie naładowane kwasy nukleinowe przemieszczają się w żelu agarozowym od katody do dodatnio naładowanej anody z prędkością zależną od ich wielkości.

Wizualizacja kwasów nukleinowych

Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść na folię. Wynik rozdziału elektroforetycznego analizować w transiluminatorze Uvitec w świetle UV.

Zalecana literatura:

‘Biochemia* J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L Stryer, PWN; W-wa 2005.

‘Biochemia Harpera" R.J. Murray, D.K. Granner, V.W. Rodwell, PZWL, W-wa 2008

„Biologia molekularna. Krótkie wykłady" PC Hames, AG McLennan, AD Bates, MRH White, PWN, W-wa 2007

„Biochemia. Krótkie wykłady" BD Hames, NM Hooper, PWN, W-wa 2005