Genetyka molekularna notatka na kolokwium

CHROMATYNA
" Eukariotyczny DNA jest upakowany jest w chromosmach
" DNA w każdym chromosomie jest pojedynczą liniową cząsteczką
" Chromatyna jest to wysoce zorganizowany kompleks DNA i białek. Umożliwia ścisłe upakowanie DNA w jądrze
" W trakcie cyklu komórkowego chromosomy znacznie zmieniają poziom swojej kondensacji. Istnieją więc różne poziomy organizacji
chromatyny.
HISTONY
" Stanowią większość białek chromatyny eukariotycznej
" Wyróżniamy wśród nich 5 klas:
o H1
o H2A, H2B, H3 i H4- HISTONY RDZENIOWE
" Wszystkie białka histonowe mają duży ładunek dodatni
" Od 20 do 30% ich sekwencji to aminokwasy lizyna i arginina
" W tracie formowania chromatyny histony mogą się silnie wiązać z ujemnie naładowanym DNA
HISTONY H1
" Duże białka
" Istnieje większa zmienność sekwencji H1 w obrębie gatunku i między innymi gatunkami
" Można go łatwiej wyizolować z całej chromatyny
" Występuje w ilości równiej połowie histonów innych klas
NUKLEOSOMY
" Rdzeń nukleosomu- struktura zawierająca fragment DNA o długości 146pz, który jest bardzo silnie zasocjowany z histonowym
oktamerem.
" Histonowy oktamer tworzy klinowaty dysk, wokół którego owinięty jest DNA o długości 146 par zasad, tworząc 1,8 lewoskrętnego
zwoju.
" Lewoskrętne owinięcie DNA zgadza się z ujemną superhelikalnością, to znaczy zwoje są skrętami superhelikalnymi
" Eukariotyczny i prokariotyczny DNA jest ujemnie superhelikalny
" Oktamer histonów a na nim nawinięte lewoskrętnie DNA
ROLA HISTONU H1
" Cząsteczka histonu H1 wiąże się z nukleosomem w miejscu, w którym DNA wchodzi i opuszcza rdzeń nukleosomu.
" W obecności H1 dalsze 20pz DNA jest chronionych przed trawieniem nukleazą
" CHROMATOSOM- rdzeń nukleosomu z histonem H1
" Histon ten zawiera dodatkowy ogon C- końcowy, który stabilizuje DNA zawarte pomiędzy rdzeniami nukleosomowymi.
" W niektórych typach komórek może zostać zastąpiony przez swój skrajny wariant H5. Histon H5 wiąże chromatynę szczególnie silnie i
jest związany z DNA nie ulegającym transkrypcji.
ACZNIKOWY DNA
" Mikrografie elektronowe cząstek rdzeniowych nukleosomów DNA ujawniły istnienie struktury nazywanej sznurem koralików .
" Jest ona złożona nukleosomów połączonych przez cienkie nici DNA.
" Ten łącznikowy DNA jest pozostałym DNA wymaganym do utworzenia fragmentów o 200pz.
" Przeciętna długość łącznikowego DNA pomiędzy cząstkami rdzeniowymi to 55pz.
WAÓKNA 30NM
" Obecność histonu H1 zwiększa stopień zorganizowania sznura koralików.
" Wraz ze zmianą stężenia soli następuje dalszy wzrost organizacji nukleosomów we włókna o średnicy 30nm.
" Nukleosomy są zwinięta w lewoskrętną helisę wyższego rzędu- SOLENOID. Na jeden obrót przypada 6 nukleosomów.
STRUKTURA WYŻSZEGO RZDU
" Organizacja chromatyny na wyższych poziomach przypomina organizację DNA prokariotycznego
" Występują domeny tworzące pętle
" Końce odcinków tworzących pętle są unieruchomione przez oddziaływania z białkowym kompleksem znanym jako rusztowanie
białkowe lub matriks jądrową.
" W komórkach DNA tworzący pętle występuje w formie włókien 30nm, a pętle tworzą układ o szerokości 300nm.
MECHANIZM KONSERWATYWNY
" Podczas replikacji dwuniciowa helisa rozplata się i każda pojedyncza nić służy jako matryca do syntezy komplementarnej nici
potomnej
" Prekursorami do syntezy DNA są 5 -trifosforany deoksyrybonukleozydów
" Każda komórka potomna otrzymuje jedną oryginalną nić rodzicielską i jedną nić nową zsyntezowaną
" Synteza postępuje według normalnych reguł parowania zasad
" Dwie nowo powstałe dwuniciowe cząsteczki przechodzą następnie w trakcie podziału komórkowego do dwóch potomnych komórek
Autor: Marta Hetman
" WIDEAKI REPLIKACYJNE- miejsce, w którym zachodzi rozdzielenie nici i synteza nowego DNA.
" Nici matrycy czytane są w kierunku 3 5 , natomiast nowe nici syntezowane są w kierunku 5 3
" SUBSTRATY DLA SYNTEZY DNA są 5 -trifosforany deoksyrybonukleozydów
o dATP
o dGTP
o dTTP
o dCTP
REPLIKONY, MIEJSCA INICJACJI I TERMINACJI
" REPLIKON- każdy odcinek DNA, który replikuje się jako pojedyncza jednostka.
" Replikacja rozpoczyna się od jednego miejsca inicjacji i postępuje (zwykle dwukierunkowo) do miejsca terminacji.
" Duże chromosomy zawierają zwykle wiele replikonów. Każdy replikon ma miejsce inicjacji. Kiedy widełki replikacyjne, należące do
sąsiadujących ze sobą OCZEK REPLIKACYJNYCH spotykają się, ulegają fuzji i tworzą w pełni zreplikowaną cząsteczkę DNA.
Zreplikowane fragmenty łączą się.
" Miejsca inicjacji są bogate w pary A-T, ponieważ ułatwia to ich otwieranie.
REPLIKACJA NIECIGAA
" W każdych widełkach replikacyjnych nić wiodąca jest syntezowana w sposób ciągły, natomiast nić opózniona jest tworzona w
postaci krótkich fragmentów
" Istnienie takiego mechanizmu wynika z możliwości syntezy DNA jedynie w kierunku 5 3 .
" Skoro dwie nici DNA biegną antyrównolegle, to jak w widełkach replikacyjnych może zachodzić kopiowanie nici rodzicielskiej ,
biegnącej 5 3 ?
o Występują FRAGMENTY OKAZAKI
" Synteza nici opóznionej rozpoczyna się w widełkach replikacyjnych z pewnym opóznieniem i przebiega w kierunku 5 3 ,
przeciwnym do miejsca inicjacji, tworząc PIERWSZY FRAGMENT OKAZAKI
" Kiedy widełki replikacyjne przesuwają się, nić wiodąca jest syntezowana w sposób ciągły. Natomiast fragmenty nici opóznionej są
wytwarzane w sposób nieciągły, w odwrotnej orientacji w stosunku do orientacji nici rodzicielskiej.
" W rzeczywistości fizyczna orientacja obu nici jest taka sama, ponieważ nić opózniona jest zwinięta w pętlę i w widełkach
replikacyjnych odwrócona o 180 stopni.
" Fragmenty są następnie łączone przez LIGAZ DNA
STARTERY RNA
" Synteza DNA rozpoczyna się od starterów RNA.
" Przed połączeniem fragmentów Okazaki startery RNA są usuwane, a powstające w wyniku tego przerwy są wypełniane przez DNA.
" Powodem inicjowania każdego fragmentu DNA przez RNA jest potrzeba zachowania szczególnej wierności replikacji
" Nić wiodąca i wszystkie fragmenty nici opóznionej rozpoczynają się od syntezy krótkich odcinków RNA, które są potem wydłużane
jako DNA
INICJACJA
" Miejsce inicjacji replikacji u prokaryota to ORI C
" Aktywacja miejsca inicjacji wymaga owinięcia DNA wokół kompleksu białek inicjatorowych oraz rozdzielenia nici
" Region Ori C zawiera cztery dziewięcionukleotydowe miejsca wiązania DnaA. 4 x 9nt (odcinki nukleotydowe)- przyłącza się DNAA I
tworzy się kompleks
" Następnie przyłącza się helikaza dnaB, która powiększa region jednoniciowy i udostępnia go do kopiowania
" DnaA tworzy kompleksy, w których każda podjednostka związana jest z cząsteczką ATP. Wokół takiego kompletu nawija się DNA oriC.
" Proces ten wymaga, aby DNA był ujemnie superhelikalny. Ułatwia to rozplatanie trzykrotnie powtórzonych trzynastonuklotydowych
sekwencji bogatych w A-T, które otwierając się umożliwiają przyłączenie się białka DnaB. 3 x 13nt OCZKO REPLIKACYJNE
" Jednoniciowy DNA w utworzonym w ten sposób w oczku zostaje opłaszczony przez białka wiążące jednoniciowy DNA (Ssb). Nie
dopuszcza to do rozerwania się nici DNA i/lub ich renaturacji.
" Następnie do DNA przyłącza się enzym PRYMAZA DNA i syntezuje krótki starter RNA, aby zainicjować syntezę nici wiodącej.
" Replisom, prymosom- kompleks białkowy rozpoczynający i kontynuujący replikację DNA poprzez rozwijanie widełek replikacyjnych.
Składa się z polimerazy DNA III, primazy, inicjatorowego białka DnaA, białka DnaB i białka DnaC.
" Startery RNA- są do tego, żeby polimeraza mogła się przyłączyć do nici.
ROZPLATANIE
" HELIKAZA DNA- przesuwa się wzdłuż nici matrycy i rozwija dwuniciową helisę DNA. Dzięki temu replikacja może być kontynuowana
poza miejscem inicjacji.
" Rozplatanie wspomaga przyłączanie się białek Ssb.
" Rozplatanie DNA w widełkach replikacyjnych zamkniętej, kolistej cząsteczki DNA prowadzi do utworzenia dodatnich superzwojów
" Dodatnie superzwoje muszą być ciągle usuwane przez wprowadzenie ujemnych superskrętów przez TOPOIMOZMERAZ TYPU II
nazywaną GYRAZ
" Inhibitory gyrazy DNA (nowobiocyna, kwas oksolinowy) są efektywnymi inhibitorami bakteryjnej replikacji i mogą być stosowane
jako antybiotyki.
WYDAUŻANIE
" Kiedy nowo utworzone widełki replikacyjne odsłaniają rodzicielską nić opóznioną, ruchomy kompleks zwany PRYMOSOMEM
(zawiera helikazę DnaB i prymazę DNA) syntezuje startery RNA i rozmieszcza je na nici opóznionej.
Autor: Marta Hetman
HOLOENZYM POLIMERAZY DNA III- wydłuża startery RNA w DNA
o Jest to dimer.
o Jedna część syntezuje nić wiodąca, a druga opóznioną.
o Obie części dimeru zawierają jedną podjednostkę alfa, mającą aktywność polimerazy i jedną podjednostkę �, która jest
EGZONUKLEAZ 3 5 sprawdzającą poprawność replikacji.
o Podjednostka � polimerazy służy jako klamra wiążąca razem enzym z DNA i umożlwiająca jego ślizgowy ruch wzdłuż DNA.
POLIMERAZA DNA I- usuwa startery i wypełnia powstałe przerwy.
o Enzym ten ma na jednym łańcuchu polipeptydowym trzy aktywności
Polimerazy 5 3
Egzonukleazy 5 3 usuwa startery
Egzonukleazy 3 5
LIGAZA DNA- odpowiada za powstanie wiązań między kolejnymi fragmentami Okazaki.
REPLISOM (APARAT REPLIKACYJNY)- tworzą go związane w kompleks DnaA, DnaB, DnaC, polimeraza DNA III oraz prymaza.
TERMINACJA I SEGREGACJA
" Para widełek replikacyjnych spotyka się przy około 180 stopni od miejsca Ori C
" W rejonie tym występuje kilka miejsc terminacji, które zatrzymują widełki, poprzez przyłączenie białka TUS.
o Jest inhibitorem helikazy DnaB
" Bezpośrednio po zakończeniu replikacji, dwie potomne, koliste cząsteczki są połączone ze sobą (KATENATY).
" Rozłącza je TOPOIZMOERAZA IV- jest odmianą TOPOIZOMERAZY DNA II.
" Następnie chromosomy mogą być rozdzielone do dwóch potomnych komórek.
POLIMERAZA DNA II- sprawdza poprawność i naprawia błędy.
RPA- białko replikacyjne u eu zamiast sbb.
Telomeraza- dobudowuje telomery na końcach nici w komórkach prapłciowych i komórkach macierzystych. Działają też w komórkach
nowotworowych.
Telomery- zabezpieczają przed sklejeniem chromosomów.
INICIACJA I MIEJSCA INICJACJI REPLIKACJI
" Replikony są inicjowane w TANDEMOWYCH GRUPACH i dochodzi do jednoczesnej inicjacji replikacji licznych replikonów
" Inicjacja zachodzi w określonym czasie podczas fazy S
" Regiony ulegające replikacji we wczesnej fazie S to przede wszystkim te, które stanowią euchromatynę (zawiera aktywny
transkrypcyjnie DNA)
" Regiony ulegające replikacji w póznej fazie S znajdują się głównie w obrębie heterochromatyny.
" DNA tworzący telomery i centromery jest replikowany jako ostatni.
" Minimalna długość DNA, która umożliwia replikację wynosi jedynie 11pz
" KOMPLEKS ROZPOZNAJCY MIEJSCE INICJACJI ORC umożliwia otwarcie DNA do kopiowania.
" W przeciwieństwie do prokariotycznych, eukariotyczne replikony mogą ulegać inicjacji tylko jeden raz w trakcie cyklu
komórkowego, ponieważ do inicjacji jest absolutnie niezbędny czynnik ograniczający.
" Istniejąca otoczka jądrowa wyklucza możliwość wniknięcia do jądra nowych cząsteczek czynnika ograniczającego.
WIDEAKI REPLIKACYJNE
" Zanim DNA zostanie skopiowane, to w widełkach replikacyjnych musi zostać ono odwinięte z nukleosomów.
" Opóznia to przesuwanie widełek do około 50pz na sekundę.
" Po przejściu widełek nowe nukleosomy zostają odtworzone z mieszaniny starych i nowo zsyntezowanych histonów
" Do rozdzielenia nici potrzebna jest helikaza DNA i białko wiążące jednoniciowy DNA
" Nić wiodąca oraz każdy fragment nici opóznionej są rozpoczynane starterem RNA (syntezowany przez prymazę, która jest integralną
częścią POLIMERAZY DNA ą)
" Polimeraza ta kontynuuje wydłużanie starterów DNA, ale szybko jest zastępowana przez POLIMERAZ DNA �
" POLIMERAZY DNA �- wypełnia ona luki na nici opóznionej, powstałe po usunięciu starterów RNA.
" Zdolność do syntezy długich cząsteczek DNA nadaje polimerazie DNA delta JDROWY ANTYGEN PROLIFERUJCYCH KOMÓREK PCNA
o Jest on funkcjonalnym odpowiednikiem podjednostki beta polimerazy DNA III
" W fazie S oprócz podwojenia DNA, zostaje podwojona też ilość histonów
MATRIKS JDROWA
" Jest to rusztowanie zbudowane z nierozpuszczalnych włókien białkowych, które organizuje strukturalne procesy jądrowe łącznie z
replikacją DNA
" FABRYKI REPLIKACYJNE, zawierające wszystkie enzymy i DNA, związane z widełkami replikacyjnymi wszystkich replikonów w obrębie
zespołu, są unieruchomione w matriks. DNA przewija się przez nie i ulega replikacji.
REPLIKACJA TELOMERÓW
" Końce liniowych chromosomów nie mogą być w pełni zreplikowane za pomocą nieciągłej replikacji, ponieważ nie mają odcinka DNA,
który mógłby być wydłużony w celu zastąpienia RNA usuniętego z końca 5 nici opóznionej
" Informacja genetyczna zawarta w chromosomach mogłaby zostać utracona.
Autor: Marta Hetman
" Aby obejść ten problem, telomery są zbudowane z setek kopii prostej, nieinformacyjnej sekwencji TTAGGG z końcem 3 wystającym
poza koniec 5 . Enzym telomeraza zawiera krótką cząsteczkę RNA, której sekwencja w części jest komplementarna do powtarzających
się sekwencji w telomerach.
" RNA działa jako matryca do syntezy powtórzeń tych sekwencji na wystającym końcu 3 , a synteza przebiega w powtarzających się
cyklach wydłużania i translokacji.
" Nić komplementarna jest syntezowana w normalny sposób jako nić opózniona, z pozostawieniem wystającego końca 3 .
" Gdy skracanie dociera do obszarów DNA zawierających informację, komórki starzeją się i umierają.
TRANSKRYPCJA WIADOMOŚCI OGÓLNE
" Transkrypcja- enzymatyczna synteza RNA na matrycy DNA.
" Jest to pierwszy etap ekspresji genów.
" Proces ten jest katalizowany przez POLIMERAZ RNA, która wymaga obecności matrycy dsDNA i prekursorowych nukleotydów:
o ATP, GTP, CTP, UTP
" Synteza RNA zachodzi od końca 5 cząsteczki RNA do jej końca 3
" Zwykle tylko jedna z dwu nici DNA jest transkrybowana. Jedna z nich zwana jest NICI SENSOWN.
" Sekwencja RNA jest taka sama jak sekwencja dekosynukleotydów nici sensownej z U zamiast T
" Druga nić nazywa się NICI ANTYSENSOWN lub nicią matrycową. Stanowi ona matrycę, z której zasadami rybonukleotydy tworzą
pary w trakcie syntezy RNA
INICJACJA
" Polimeraza RNA wiąże się z dsDNA i inicjuje transkrypcję w miejscu zwanym PROMOTOROWYM
" Promotory- są to sekwencje DNA, które znajdują się początku genu, od strony 5 , przed regionem kodującym.
" W sekwencji promotorów różnych genów występują często sekwencje zachowawcze. Krótkie sekwencje zachowawcze w
promotorach są miejscami wiązań polimerazy lub innego białka wiążącego się z DNA w celu inicjacji lub regulacji transkrypcji.
" Aby matrycowa nić mogła brać udział w parowaniu zasad, DNA musi ulec lokalnemu rozpleceniu.
" Rozplatanie zaczyna się w miejscu promotorowym, z którym wiąże się polimeraza RNA.
" Następnie polimeraza inicjuje syntezę nici RNA w MIEJSCU STARTU (miejsce inicjacji). Oznacza się je w sekwencji genu jako pozycję
+1.
ELONGACJA
" Polimeraza RNA wiąże rybonukleotydy z końcem 3 tworzącego się łańcucha RNA.
" Aańcuch powstaje w kierunkach 5 3 .
" W trakcie tego procesu enzym przesuwa się wzdłuż antysensownej nici DNA w kierunku 3 5 .
" W trakcie przesuwania się enzymu, DNA ulega miejscowemu rozpleceniu.
" Za polimerazą tworzy się ponownie struktura helisy.
TERMINACJA
" Dysocjacja kompleksu transkrypcyjnego i zakończenie syntezy RNA
" Odbywa się w MIEJSCU TERMINACYJNYM
" Sekwencje te często zawierają regiony względem siebie komplementarne, które mogą tworzyć w RNA strukturę zwaną SPINKA DO
WAOSÓW. Powoduje ona zatrzymanie się transkrypcji.
" Jeden z największych enzymów w komórce bakterii
" Składa się z co najmniej 5 podjednostek.
" W holoenzymie znajdują się 2
" Do inicjacji transkrypcji potrzebny jest cały enzym, ale do elongacji nie jest potrzebny czynnik sigma, dlatego jest on uwalniany z
kompleksu transkrypcyjnego po inicjacji
" Reszta enzymu RDZEC ENZYMU przemieszcza się wzdłuż DNA. Ma strukturę 2 .
PODJEDNOSTKA ALFA
" Jest odpowiedzialna za montaż rdzenia polimerazy.
" W rdzeniu polimerazy RNA znajdują się dwie podjednostki alfa
" Podjednostka alfa jest kodowana przez gen rpoA
PODJEDNOSTKA BETA
" Jest odpowiedzialna za dostawianie substratów w trakcie trwania procesu transkrypcji, czyli trifosforanów rybonukleozydów. (ATP,
GTP, UTP, CTP)
" Podjednostka beta ma dwie domeny odpowiedzialne za inicjację transkrypcji i elongację
PODJEDNOSTKA BETA PRIM
" Odpowiedzialna za związanie rdzenia z promotorem.
" Podjednostka ta kodowana jest przez gen rpoC
" Wiąże dwa jony Zn2+.
" Z podjednostką tą wiąże się polianion- HEPARYNA
" Heparyna inhibuje transkrypcję i współzawodniczy z DNA o miejsce wiązania
Autor: Marta Hetman
" Podjednostka ta odpowiedzialna jest za wiązanie polimerazy z matrycą DNA
CZYNNIK SIGMA
" Podjednostka sigma rozpoznaje sekwencję -35 i cały holoenzym się przesuwa w miejsce startu.
" Jest odpowiedzialny za rozpoznanie promotora
" Nie jest konieczny do elongacji.
" Sigma jest doczepiona do holoenzymu do momentu, gdy zsyntetyzuje ok. 8-9 pierwszych nukleotydów. Oddysocjowuje się i szuka
kolejnego rdzenia. I kończy się inicjacja.
PROMOTOR
o Zawiera krótkie odcinki zachowawcze
o Ma długość około 40pz
o Ma sekwencje -35 (TTGACA) i -10 (6pz sekwencja TATAAT)
o Minusy i cyfry, bo jest to powyżej miejsca startu +1.
o -10 kaseta PRIBNOVA.
o *topnienie DNA- rozrywanie wiązań wodorowych. Tworzy się BBEL TRANSKRYPCYJNY.
Początek transkrypcji to wytworzenie wiązania między DNA a polimerazą RNA. Związanie enzymu zachodzi na promotorze. Transkrypcja
zachodzi na poziomie zasad odpowiadającej pozycji +1.
KOMPLEKS BIAAKOWY DLA POLIMERAZY II.
Czynniki transkrypcyjne dla polimerazy II. Muszą się one przyłączyć do kasety TATA.
" TF II D TBP (czynnik wiążący DNA) + TAF II (czynniki towarzyszące białku TBP)
" TF II A
" TF II B
" Przyłącza się polimeraza II
" TF II F
" TF II E
" TF II H odpowiedzialny za fosforylację (uaktywnienie) polimerazy. Aby polimeraza zadziałała to musi ulec fosforylacji.
" TF II J
" Wymienione w kolejności przyłączania do promotora.
" Promotor- jest w nim kaseta TATA między innymi. Sekwencja TATA jest na ok. -25-30 par zasad powyżej miejsca startu.
" Sekwencja CCAAT w pozycji -80. Występuje czasem.
Ledwo po zaczęciu transkrypcji przyłączana jest do końca 5 transkryptu czapeczka, jako ochrona przed nukleazami, które są w jądrze
komórkowym. Jest zbudowana z jednego nukleotydu 7mG (7-metyloguanozyna). Przyłączana jest wiązaniem fosfodiestrowymi w specyficzny
sposób wiązaniem 5 -5 .
Guanylilo-transferaza- przyczepia czapeczkę do końca 5 wiązaniem fosfodiestrowymi 5 -5 .
Do końca 3 dołącza się ogonek poliA. Przyłącza się tutaj dużo A (od 150 do 300). Kiedy rozpoznawane jest specyficzne miejsce cięcia odcinany
jest koniec 3 i dostawiany jest ogonek poliA. Występuje polimeraza poliA.
SPLICING- na końcach intronów znajdują się sekwencje dwunukleotydowe- sekwencje zgodne. Każdy intron ma swój koniec 5 i 3 . Umożliwia
to precyzyjne wycinanie intronów z preRNA. SnRNA bierze udział w splicingu. Jak się wycina intron, to zawija on się w lasso (dociągana jest
druga część- egzon i kiedy lasso jest wycinane, to egzony są blisko siebie i są od razu łączone).
Alternatywny splicing- w zależności od zapotrzebowania organizmu.
RNA może ulegać metylacji na różne sposoby. Powoduje to wyciszanie pewnych miejsc. Unieczynnia je. Metylacji ulegają zasady cytozynowe w
Mrna.
Jak już jest ładne mRrna z czapeczką i bez intronów, to jest ono transportowane do cytoplazmy, bo tam czekają na niego rybosomu.
WIZANIE PROMOTORA
" Rdzeń polimerazy RNA tworzy z DNA LUyNE POACZENIA.
" Kiedy czynnik sigma dołącza do rdzenia enzymu zmieniając go w holoenzym, powinowactwo do niespecyficznych miejsc DNA
zmniejsza się.
" U E. coli holoenzymu odszukuje promotory i wiąże się z nimi bardzo szybko. Proces ten polega na przesuwaniu się polimerazy wzdłuż
DNA aż do napotkania sekwencji promotorowej.
" W miejscu promotorowym polimeraza rozpoznaje dwuniciowe sekwencje DNA -35 i -10.
ROZPLECENIE DNA
" DNA jest rozplątywane przez polimerazę
" Ujemne superzwinięcie wzmaga transkrypcję wielu genów, ponieważ ułatwia polimerazie rozplecenie DNA
" Początkowe rozplecenie DNA prowadzi do utworzenia OTWARTEGO KOMPLEKSU z polimerazą. Proces ten nazywa się ścisłym
wiązaniem.
INICJACJA SYNTEZY AACCUCHA RNA
" Prawie wszystkie miejsca startu syntezy łańcucha RNA zawierają resztę purynową
Autor: Marta Hetman
" Synteza RNA zachodzi bez startera
" Synteza łańcucha zaczyna się od GTP lub ATP.
" Polimeraza wbudowuje dwa pierwsze nukleotydy i tworzy między nimi wiązanie fosfodiestrowe
" Pierwsze 9 nukleotydów zostaje połączonych bez przesuwania się enzymu wzdłuż DNA
ELONGACJA AACCUCHA RNA
" Po udanej inicjacji enzym uwalnia czynnik sigma i tworzy potrójny kompleks polimeraza-DNA-powstający RNA
" Polimeraza przesuwa się wzdłuż DNA- UWOLNIENIE PROMOTORA, pozwalając na ponowną inicjację transkrypcji z tego samego
promotora przez następną cząsteczkę polimerazy RNA
" Region rozplecionego DNA- BBEL TRANSKRYPCYJNY przesuwa się z polimerazą wzdłuż DNA.
" Polimeraza rozrywa wiązania wodorowe. Nie ma innego enzymu.
" Polimeraza rozplata DNA przed bąblem transkrypcyjnym i splata tuż za nim.
" Helisa RNA-DNA musi również obracać się za każdym razem po dodaniu kolejnego nukleotydu do łańcucha RNA.
" U pro nie ma jądra, więc w momencie, kiedy zostanie zsyntezowany jakiś fragment RNA to od razu się przyłącza rybosom.
TERMINACJA
" Polimeraza RNA zostaje związana z DNA i kontynuuje transkrypcję aż dotrze do sekwencji terminacyjnej (sygnał stop)
" Najczęściej występującym sygnałem stop jest struktura spinki do włosów.
" Struktura ramienia jest bardzo bogata w pary C-G, co zwiększa stabilność parowania zasad
" Taka struktura poprzedza często sekwencję czterech lub więcej reszt U
" Każdy gen kończy się sekwencją terminatora.
" Sekwencja DNA zawierająca regiony względem siebie komplementarne, dlatego w wyprodukowanym RNA te elementy
komplementarne są widoczne i one się połączą i może się tworzyć spinka do włosów.
" Spinka jest bogata w cytozynę i guaninę. Są do siebie komplementarne.
" Sekwencja DNA, z której po transkrypcji powstaje spinka do włosów. 5 CCCGGCG NNNNN GGGCCGC 3
" Palindrom- sekwencja w DNA posiadająca rotacyjną oś symetrii, która czytana od przeciwległych końców (po niciach 5 ) daje to
samo.
TRANSKRYPCJA RHO-NIEZALEŻNA
" Rodzaj transkrypcji, gdzie są sekwencje palindromowe w DNA i tworzą się struktury spinki do włosów.
" Nie wymaga białka rho.
" Za spinką do włosów musi być kilka uracyli (min. 4).
" Uracyle umożliwiają łatwe zerwanie wiązań wodorowych i uwolnienie transkryptu.
" Ta spinka, która powstaje powoduje zmianę konformacji przestrzennej polimerazy i przestaje ona działać i kończy się transkrypcja.
TERMINACJA ZALEŻNA OD RHO
" Drugi sposób zakończenia transkrypcji. Wymagany jest udział białka rho.
" W terminatorach rho zależnych może być spinka, ale nie musi być. Na pewno nie ma sekwencji U. Są niepotrzebne, bo
oddysocjowanie jest spowodowane białkiem rho.
" Białko rho się przyczepia do specyficznego miejsca na RNA.
" Białko rho przesuwa się w kierunku 3 po transkrypcie, czyli w kierunku polimerazy. goni polimerazę i jak ją złapie to zmienia jej
konformację przestrzenna i przestaje ona działać, w związku z tym kończy się transkrypcja.
EUKARIOTYCZNE POLIMERAZY RNA
" U Eukaryota za transkrypcję różnych klas genów odpowiadają trzy polimerazy RNA.
POLIMERAZA RNA I (RNA POL 1)
" Transkrybuje większość genów rRNA.
" Znajduje się w jąderku
" Syntetyzuje pre-rRNA 28S, 18S, 5,8S
POLIMERAZA RNA II (RNA POL II)
" Transkrybuje wszystkie geny kodujące białka i niektóre geny małych jądrowych RNA (snRNA)
" Znajduje się w nukleoplazmie
" Syntezuje pre-mRNA i snRNA (małe jądrowe)
POLIMERAZA RNA III (RNA POL III)
" Transkrybuje geny:
o tRNA
o 5S rRNA
o snRNA
" Znajduje się w nukleoplazmie
PODJEDNOSTKI POLIMERAZ RNA
" Wszystkie trzy polimerazy są dużymi enzymami zawierającymi 12 lub więcej podjednostek
Autor: Marta Hetman
" Wszystkie polimerazy eukariotyczne mają podjednostki wskazujące homologię do podjednostek zawartych w rdzeniu polimerazy
RNA 2
DOMENA CTD POLIMERAZY RNA II
" Koniec karboksylowy RNA Pol II zawiera ciąg 7 aminokwasów
" Ten heptapeptyd ma następującą sekwencję Tyr- Ser- Pro- The- Ser- Pro- Ser i znany jest pod nazwą KARBOKSYLOWEJ DOMENY
TERMINALNEJ CTD
" Powtórzenia te są istotne dla funkcji życiowych
" RNA Pol II katalizuje transkrypcję wszystkich genów kodujących białka
INTERAKCJA KODON-ANTYKODON
" ANTYKODON tRNA oddziałuje z KODONEM mRNA, gdy oba zbliżają się do siebie w szczelinie rybosomu.
" Ułożenie oddziałujących nici RNA jest antyrównolegle.
MIEJSCA WIŻCE RYBOSOM
" W prokariotycznym mRNA jest to zachowawcza sekwencja leżąca 8-13 nukleotydów powyżej pierwszego kodonu, który ulega
translacji.
" Jest to sekwencja bogata w puryny, zawierająca zwykle całą lub część sekwencji 5 -AGGAGG-3 .
" Nazwano ją MIEJSCEM WIŻCYM RYBOSOM lub SEKWENCJ SHINE-DALGARNO
POLISOMY
" POLISOM- kompleks wielu rybosomów znajdujących się na jednym mRNA.
INICJATOROWY tRNA
" Pierwszym aminokwasem włączonym do białka jest metionina
o U prokariotów metionina jest zmodyfikowana do N-formylometioniny
o Metionina jest przyłączana do dwóch tRNA przez syntetazę metionylo-tRNA
" Mechanizm syntezy białka można podzielić na trzy etapy
o INICIACJ- organizowanie się kompleksu rybosom-mRNA
o ELONGACJ- powtarzalne cykle dodawania aminokwasów
o TERMINACJ- uwolnienie łańcucha polipeptydowego
" Czynniki inicjujące i elongacyjne u PROKARYOTA są oznaczane w skrócie IF i EF
" Czynniki inicjujące i elongacyjne u EUKARYOTA są oznaczane w skrócie eIF i Eef
INICJACJA
" Jest to zorganizowanie się kompletnego rybosomu na cząsteczce mRNA we właściwym punkcie startu KODONIE INICJATOROWYM
" KOMPONENTY ZAANGAŻOWANE S TO:
o Mała i duża podjednostka rybosomu
o mRNA
o inicjatorowy aminoacylo-tRNA
o trzy czynniki inicjujące IF1, IF2, IF3
o GTP
1. Przyłączają się do małej podjednostki rybosomu 30S, hamując tym samym przedwczesne dołączenie się dużej
podjednostki do małej. Zapobiegają formowaniu się nieaktywnym rybosomów.
2. - tworzy kompleks z GTP i wiąże się do małej podjednostki. Umożliwia wiązanie inicjatorowego metionylo-tRNA. Jest sygnałem,
do przyłączenia się jednostki mRNA. Mała podjednostka rybosomu rozpoznaje odpowiednie miejsce w cząsteczce mRNA.
3. Ż , miejsce u pro, do którego wiąże się rybosom małą
podjednostką. 6 nukleotydowa sekwencja poprzedzająca kodon startowy AUG.
4. Rybosom się przyczepia, a czynniki szybko oddysocjują i w międzyczasie przyłącza się tRNA z pierwszym aminokwasem i powstaje
pierwsze amino-acylo-trna.
5. U pro pierwszym aminokwasem jest formylo-metionylo-trna. U eukaryota jest to metionylo-trna. Nie mamy enzymów
formylujących. Grupa formylowa nie jest doczepiana.
6. Uwalniany jest ponieważ, nie dopuszcza on do połączenia się podjednostek. Powstały kompleks to KOMPLEKS INICJUJCY 30S.
7. Z powstałym kompleksem 30S wiąże się podjednostka 50S, co uwalnia IF1 i IF2 i zużywa energię pochodzącą z hydrolizy GTP.
Powstaje KOMPLEKS INICJUJCY 70S.
" Kompletny rybosom ma dwa miejsca wiążące tRNA. Nazwano je miejscami:
o A (MIEJSCE AMINOACETYLOWE)
Wiązane są cząsteczki aminoacetylowe-tRNA
Wszystkie pozostałe tRNA
o P (MIEJSCE PEPTYDOWE)
Znajduje się w nim peptydylo-tRNA gotowy do wydłużania o resztę jednego aminokwasu, związanego z tRNA w
miejscu A
Autor: Marta Hetman
" Głównym rezultatem inicjacji jest umieszczenie inicjatorowego tRNA w miejscu P. jest to jedyny tRNA, który może tego dokonać,
gdyż wszystkie pozostałe muszą wchodzić do rybosomu w miejscu A.
ELONGACJA
" Rozpoczyna się, gdy kolejne amino-acylo-trna przyłączy się do miejsca A.
" Wraz z uformowaniem KOMPLEKSU 70S rozpoczyna się CYKL ELONGACYJNY.
" Dzielimy ten proces na 3 etapy:
o DOSTARCZENIE AMINOACYLO-tRNA
Aby dostarczyć aminoacylo-tRNA do miejsca A rybosomu wymagany jest udział EF-Tu oraz energia pochodząca z
hydrolizy GTP.
Uwolniony kompleks EF-Tu-GDP jest regenerowany przez EF-Ts.
EF-Ts usuwa GDP z kompleksu EF-Tu-GDP, by następnie zostać usuniętym przez GTP
Powstaje kompleks EF-Tu-GTP, który znowu jest zdolny do wiązania aminoacylo-tRNA i dostarczenia go do
rybosomu.
o TWORZENIE WIZAC PEPTYDOWYCH
Po dostarczeniu aminoacylo-tRNA, miejsca A i P są zajęte i oba aminokwasy znajdują się blisko siebie.
PEPTYDYLOTRANSFERAZA może utworzyć wiązanie peptydowe między tymi dwoma aminokwasami bez
dostarczania dodatkowej energii
o TRANSLOKACJA
Kompleks EF-G (TRANSLOKAZA) i GTP wiąże się do rybosomu.
Następnie deacylowany tRNA jest usuwany z miejsca P. wymagany jest nakład energii.
Peptydylo-tRNA jest usuwany z miejsca A do P.
mRNA przesuwa się o jeden kodon w stosunku do rybosomu.
GDP oraz EF-G są uwalniane.
Nowy kodon znajduje się w wolnym miejscu A.
" Podczas elongacji działają trzy czynniki elongacyjne
o EF-Tu działa w połączeniu z GTP. Przynosi amino-acylo-trna do miejsca A. następnie uwalniana jest energia z GTP i
powstaje GDP.
o EF-Ts regeneruje czynnik EF-Tu.
o EF-G jest odpowiedzialny za translokację tRNA. Zawiera translokazę.
" Cykl elongacyjny zostanie zakończony w momencie pojawienia się w miejscu A kodonu terminacyjnego KODONU STOP.
TERMINACJA
" Kodon stop rozpoznający jest przez czynniki uwalniające RF.
" Czynniki uwalniające RF oddziałują z tymi kodonami i powodują uwolnienie gotowego już łańcucha polipeptydowego.
" RF1 rozpoznaje kodony UAA oraz UAG.
" RF2 rozpoznaje UAA oraz UGA.
" RF3 pomaga w przeprowadzeniu reakcji RF1 lub RF2.
" Aańcuch zostaje przeniesiony przez peptydylotransferazę na cząsteczkę wody, aby dokończyło się tam wiązanie peptydowe.
" Translokaza powoduje uwolnienie łańcucha. Przyłącza się do małej podjednostki czynniki IF3 i powoduje, że kompleks się rozpada i
nie może się przyłączyć duża podjednostka i kończy się translacja.
" EF-G wraz z czynnikiem uwalniającym rybosomy powodują dysocjację rybosomu na podjednostki.
" Następnie IF3 może ponownie wiązać się do małej podjednostki, by zapobiec powstaniu nieaktywnych rybosomów 70S.
INFORMACJE OGÓLNE
" Odnalezienie właściwego kodonu start przebiega na drodze SKANINGOWANIA MRNA, gdyż eukariotyczny mRNA nie ma sekwencji
wiążących rybosom.
" Pierwszym aminokwasem jest metionylo-trna
SKANING
" Brak w eukariotycznym mRNA sekwencji Shine-Dalgarno, mechanizm selekcji kodonu start jest inny.
" Podjednostka 40S zawierająca przyłączony inicjatorowy tRNA wiąże się do końca 5 mRNA i skanuje mRNA tak długo aż znajdzie
właściwy kodon AUG.
" Musi się on znajdować we właściwym otoczeniu KONTEKŚCIE SEKWENCYJNYM 5 -CCRCCAUGG-3 , gdzie R oznacza purynę.
INICJACJA
Czynniki biorące udział w syntezie białka można podzielić na grupy o eIF4B oraz eIF4F
" WIŻCE SI Z PODJEDNOSTKAMI RYBOSOMOWYMI o eIF4F- kompleks wiążący strukturę kap.
o eIF6 " DOSTARCZAJCE DO RYBOSOMÓW INICJATOROWY
o eIF3 tRNA
o eIF4C o eIF2
" WIŻCE SI Z MRNA o eIF2B
o Rozpoczynają strukturę 5 -kap " USUWAJCE INNE CZYNNIKI
o Powodują stopienie się jego struktury o eIF5- uwalnia dwa czynniki, umożliwiając
drugorzędowej wiązanie podjednostki 60S
Podczas inicjacji, której punktem wyjścia są wolne podjednostki 40S rybosomu oraz cząsteczki mRNA zachodzi ciąg zdarzeń
Autor: Marta Hetman
1. czynniki eIF3 oraz eIF4C wiążą się do podjednostki 40S.
2. pozwala to na powstanie kompleksu składającego się z trzech składników
a. inicjatorowego RNA
b. eIF2
c. GTP
3. Kolejność organizowania się rybosomu jest inna niż u prokariotów. Tam inicjatorowy tRNA zostaje związany z małą podjednostką
przed jej związaniem z mRNA.
4. Zanim kompleks potrójny zwiąże się z mRNA, ten ostatni musi się związać z eIF4B i eIF4F i pozbawieniu struktur drugorzędowych.
5. Gdy kompleks podjednostki 40S zwiąże się przez kap z kompleksem mRNA, zostaje uruchomiony proces poszukiwania kodonu AUG w
mRNA.
6. Aby mogła się przyłączyć podjednostka 60S, czynniki eIF2 i eIF3 zostają wyparte przez eIF5. Wymaga to hydrolizy GTP.
7. Wiązanie podjednostki 60S ułatwia czynnik eIF4C.
8. Formuje się KOMPLEKS INICJUJCY 80S
TERMINACJA
" Jeden czynnik uwalniający eRF, rozpoznaje wszystkie trzy kodony STOP i pełni rolę odpowiedników prokariotycznych RF1 (lub RF2)
oraz RF3.
" eRF do swojej aktywności wymaga GTP.
CENTROMER
" jest to region, w którym łączą się dwie siostrzane chromatydy
" jest to miejsce, w którym przyłącza się wrzeciono mitotyczne
" centromery cechują specyficzne, krótkie sekwencje DNA
TELOMERY
" fragment chromosomu, zlokalizowany na jego końcu, który zabezpiecza go przed uszkodzeniem podczas kopiowania.
" Telomer skraca się podczas każdego podziału komórki
" Telomer to element strukturalny chromosomu zapewniający mu stabilność.
" Telomer nie zawiera żadnych genów i w konsekwencji nie koduje żadnych białek.
" Sekwencja składająca się na telomer człowieka jest niezmienna, powtarzalna 5 -TTAGGG-3
" Końce liniowego, chromosomowego DNA przed degradacją i stopniowym skracaniem są zabezpieczone przez telomerazy
HETEROCHROMATYNA " Jest najbardziej rozproszonym regionem chromosomu
" Jest częścią chromatyny w interfazie interfazowego.
" Jest skondensowana " Składa się z obszarów nieaktywynych, występujących w
" Jest transkrypcyjnie nieaktywna postaci włókien 30nm oraz regionów aktywnie
transkrybowanych
" Pojedyncze nukleosomy mogą być zastępowane przez
białka inicjujące transkrypcję
EUCHROMATYNA
EKSPRESJA GENÓW PROKARIOTYCZNYCH
" U pro POLIMERAZA RNA transkrybuje gen poczynając od PROMOTORA (sekwencja DNA określająca start transkrypcji) a kończąc na
sekwencji TERMINATORA.
" Powstający informacyjny RNA może zawierać regiony kodujące jedno lub kilka białek (RNA POLICISTRONOWY).
" Region kodujący DNA nazywany jest operonem.
" Regiony kodujące informacyjnego RNA ulegają translacji na białka przez rybosomy.
" Rybosomy wiążą informacyjny RNA w RBS i tłumaczą informację w nim zawartą na sekwencję aminokwasów, zaczynając kodonu
inicjatorowego, a kończąc na kodonie stop. W tym procesie wykorzystywane są transportujące RNA.
" Są to małe cząsteczki zbudowane w strukturze liniowej z 74-95 nukleotydów.
" Wszystkie cząsteczki tRNA charakteryzują się występowaniem zmodyfikowanych zasad azotowych.
" Jego zadaniem jest przyłączanie wolnych aminokwasów w cytoplazmie i transportowanie ich do rybosomów, gdzie w trakcie procesu
translacji zostają włączone do łańcucha polipeptydowego.
" tRNA cechuje wysoka specyficzność w stosunku do aminokwasów.
" Cząsteczki tRNA występują w komórkach w stanie wolnym bądz też związane ze specyficznym aminokwasem. Kompleks tRNA-
aminokwas nosi nazwę aminoacylo-tRNA.
BUDOWA
" Wzór strukturalny tRNA przyjmuje kształt czterolistnej koniczyny w którym można wyróżnić 4 ramiona:
o Pętla dihydrouracylowa DHU po stronie 5 . Struktura spinki do włosów z dihydroksyuracylem. Określa, jaki aminokwas
przyłączy się do danego tRNA.
o Ramie akceptorowe- dzięki sekwencji 5 -CCA-3 powoduje, że cały tRNA jest aktywny i może się przyłączyć aminokwas.
Enzymy przyczepiające aminokwas do tRNA- SYNTETAZY AMINOACYLO-tRNA. Proces przyłączania to aminoacylacja.
Autor: Marta Hetman
o Ramię zmienne
o Pętla T�c - zbudowana z ramienia oraz pętli, w której występuje charakterystyczny układ zasad: rybotymidyna (T),
pseudourydyna (�) oraz cytozyna (C). Ramię służy do łączenia się z rybosomem i umocowania tRNA na matrycy.
o Pętla antykodonowa zawiera 7 nukleotydów. Trzy środkowe tworzą antykodon. Odpowiedzialna za rozpoznanie i
związanie z kodonem w mRNA.
REGUAA TOLERANCJI CRICKA- hipoteza wooble a. Pomiędzy 3 pozycją kodonu a 1 pozycją antykodonu. Zachodzące w procesie translacji
dopasowanie kodonu w mRNA z odpowiadającym mu antykodonem w tRNA nie zawsze musi być idealne. Zgodnie z zasadą tolerancji zawsze
musi być zachowana jedynie zgodność pomiędzy dwoma pierwszymi nukleotydami kodonu i antykodonu. Na ostatniej pozycji kodonu
dopuszczalne jest czasami wiązanie tRNA przez nukleotyd niekomplementarny. Na przykład zarówno adenina, jak i cytozyna na trzeciej pozycji
kodonu mogą tworzyć parę z uracylem w antykodonie. Tak więc ta sama cząsteczka tRNA, połączonego z aminokwasem, czyli tworzącego
aminoacylo-tRNA może przyłączać się do kilku kodonów, choć zawiera tylko jeden antykodon.
ROLA W TRANSLACJI
o Podczas biosyntezy białka służy do transportu odpowiednich aminokwasów i wstawiania ich w odpowiednie miejsca na rybosomach.
o pełnią rolę przekaznika między sekwencją rybonukleotydową mRNA, a sekwencją aminokwasów w polipeptydzie
o rozpoznają kodon na mRNA, dzięki czemu mogą dostarczyć odpowiedni aminokwas
mRNA- służy za matrycę, na której budowane są białka.
" CHROMATYDA- jest to połówka chromosomu. Buduje ramiona chromosomu.
" CENTROMER- miejsce połączenia dwóch chromatyd siostrzanych oraz przyłączenia wrzeciona kariokinetycznego.
" PRZEWŻENIE PIERWOTNE- odcinek heterochromatyny wokół centromeru.
" PRZEWŻENIE WTÓRNE- sekwencja DNA, która służy jako organizator jąderkotwórczy do syntezy rRNA
" SATELITA (TRABANT) kolejny odcinek heterochromatyny.
" METACENTRYCZNY- centromer umieszczony w połowie długości chromosomu.
" SUBMETACENTRYCZNY- centromer dzieli ramiona chromosomu na odcinki nierównej długości.
" AKROCENTRYCZNY- centromer połączony tuż przy jednym z końców ramion chromosomu.
" TELOCENTRYCZNY- centromer umieszczony na końcu ramion chromosomu.
" Jest to relacja między sekwencją 4 zasad w kwasach nukleinowych a sekwencją 20 aminokwasów w białku
" Kod jest TRÓJKOWY - trzy nukleotydy kodują jeden aminokwas.
" Mamy 20 aminokwasów, a 64 tryplety. Dlatego większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden tryplet. Kod jest
zatem ZDEGENEROWANY- wieloznaczny. Spowodowane tym, że 18 z 20 aminokwasów kodowanych jest przez więcej niż jeden
kodon, zwanych wtedy KODONAMI SYNONIMICZNYMI. Tylko metionina i tryptofan mają po jednym kodonie.
" Jeśli w drugiej pozycji znajduje się pirymidyna, to tryplet koduje aminokwas hydrofilowy.
" Jeśli w drugiej pozycji znajduje się puryna, to tryplet koduje aminokwas polarny.
" Od ustalonego punktu startu każdy tryplet w rejonie kodującym mRNA reprezentuje kodon rozpoznawany przez komplementarny
tryplet- ANTYKODON, który znajduje się w obrębie Trna
" JEDNOZNACZNY- każdy kodon koduje wyłącznie jeden aminokwas.
" NIEZACHODZCY- Pojedynczy nukleotyd wchodzi w skład wyłącznie jednego określonego kodonu.
" BEZPRZECINKOWY- Między kodonami nie ma żadnych przerw.
" UNIWERSALNY
WPAYW MUTACJI
" Najczęstszym typem mutacji jest TRANZYCJA
o Puryna zmienia się w drugi rodzaj puryny
o Pirymidyna zmienia się w drugi rodzaj pirymidyny
" Występują również TRANSWERSJE
o Pirymidyna zamienia się na purynę
o Puryna zamienia się na pirymidynę
UNIWERSALNOŚĆ
" Uważa się, że kod genetyczny jest taki sam we wszystkich organizmach
" Obecnie wiadomo również, że niektóre organizmy jednokomórkowe używają kodu genetycznego, który wykazuje odstępstwa od
kodu uniwersalnego
" występują inne kodony charakterystyczne, np.:
o w mitochondriach AGA i AGG to kodony STOP, a AUA koduje metioninę
o u niektórych pierwotniaków UAA i UGA nie są kodonami STOP
o za start u prokaryota odpowiada GUG, UUG
o zachodzenie na siebie kodonów u bakteriofagów
Autor: Marta Hetman
o w mitochondrium DNA ssaków UGA nie jest sygnałem stop. Koduje tryptofan. Natomiast AGA jest kodonem stop.
ORF
" W DNA występują grupy przylegających do siebie kodonów, które zaczynają się kodonem start ATG, a kończą się kodonem stop TGA,
TAA, TAG. Takie sekwencje nukleotydowe nazywamy OTWARTYMI RAMKI ODCZYTU lub ORF
" Jeśli wiemy, że konkretna ORF koduje białko, to mówimy o tzw. Rejonie kodującym. Stąd wniosek, że jakakolwiek ORF jest
przypuszczalnym rejonem kodującym.
OPERONY
występują u bakterii. Jest to region w genomie, który posiada geny kodujące odpowiednie białka. Występuje też region regulatorowy, który
wszystkim steruje. Operony służą do reagowania na zmiany środowiska u bakterii. Zmiany najczęściej dotyczą jedzenia. Bakterie oszczędzają
energię, dzięki operonowi. Jest to bardzo szybki sposób reagowania.
o GENY STRUKTURY
o ELEMENTY KONTROLNE- takie jak sekwencja operatorowa. Jest to sekwencja DNA regulującą transkrypcję genów
struktury.
o GEN REGULATOROWY- jego produkt (np. represor) rozpoznaje elementy kontrolne. Represor wiąże się z sekwencją
operatora.
Są dwa typy operonów:
" Indukowany- przeważnie kataboliczny. Dotyczy rozpadów cząsteczki, np. laktozy. Kataboliczny operon. Jak się coś pojawi w
środowisku, co się da zużyć jako zródło węgla i energii, to bakteria włącza sobie operon. Włącza się tylko i wyłącznie wtedy, gdy
laktoza będzie jedynym zródłem węgla. Najpierw będzie zużyta glukoza, gdyż ona obniża stężenie cAMP który jest niezbędny do
aktywacji białka, które pozwoli nam włączyć operon laktozowy, gdy się skończy glukoza. Jeżeli laktoza jest jedynym dopuszczalnym
zródłem węgla i energii, to bakteria włącza operon i produkuje enzymy, które posłużą do zużycia laktozy. Jeśli jej nie ma, to po co
produkować enzymy. Glukoza jest monosacharydem. cAMP dzięki niemu jest blokowane włączanie operonu laktozowego. Nie
pracuje tak długo, jak jest glukoza.
" Hamowany- jest związany z biosyntezą, np. biosynteza tryptofanu.
OPERON LAKTOZOWY
E. coli może wykorzystywać laktozę jako zródło energii i węgla. Enzymy do tego potrzebne syntezowane są tylko wówczas, gdy laktoza jest
jedynym dostępnym zródłem węgla.
Operon laktozowy złożony jest z trzech genów struktury, które stanowią jedną transkrypcyjną jednostkę lacZYA. Zawiera ona promotor .
Produktem ekspresji tych genów jest POLICISTRONOWY mRNA
" lacZ
o Koduje �-galaktozydazę. Jest to enzym odpowiedzialny za hydrolizę laktozy do galaktozy i glukozy.
" lacY
o Koduje permeazę galaktozydową. Jest ona odpowiedzialna za transport laktozy przez ścianę komórkową bakterii.
" lacA
o Koduje transacetylazę tiogalaktozydową
Jednostka transkrypcyjna lacZYA ma miejsce operatorowe.
" jest usytuowane na odcinku między zasadami -5 i +21 przy końcu 5 operonu laktozowego.
" wiąże białko zwane represorem lac, które po związaniu z operatorem jest silnym inhibitorem transkrypcji.
REPRESOR LAC
" Represor lac- kodowany przez osoby gen regulatorowy lacI.
" Miejsce operatorowe lac złożone jest z 28 par zasad o sekwencji palindromowej
" Przy braku laktozy REPRESOR wiąże się z OPERATOREM.
" Represor i polimeraza RNA mogą się wiązać równocześnie z miejscem PROMOTOROWYM LAC i OPERATOREM.
" Gdy REPRESOR LAC związany jest z sekwencją DNA operatora polimeraza równocześnie może się związać się z sąsiednią sekwencją
promotorową
PALINDROM
" Jest to sekwencja jednakowa zarówno na jednej nici odczytywanej od strony lewej do prawej w kierunki 5 do 3 . Jak i na nici
komplementarnej odczytywanej od strony prawej do lewej, w kierunku 5 do 3 .
INDUKCJA
W nieobecności induktora REPRESOR LAC ogranicza transkrypcję lacZYA do bardzo niskiego poziomu. Po dodaniu do komórek laktozy, poziom
permeazy umożliwia pobranie laktozy przez bakterię, a �-galaktozydaza katalizuje konwersję części laktozy w ALLOLAKTOZ.
ALLOLAKTOZA
" Działa jak induktor
" Wiąże się z REPRESOREM LAC
" Usunięcie REPRESORA LAC z miejsca operatorowego pozwala polimerazie zacząć transkrypcję genów lacZYA
BIAAKO RECEPTOROWE CYKLICZNEGO AMP i REPRESJA KATABOLICZNA
Autor: Marta Hetman
" W przypadku obecności w środowisku bakterii glukozy i laktozy, jako zródło węgla i energii wykorzystuje ona najpierw glukozę.
Glukoza zmniejsza stężenie cAMP w komórce, które aktywuje niezbędne białko do włączenia operonu laktozowego, kiedy kończy się
glukoza. Jeżeli laktoza jest jedynym dopuszczalnym zródłem węgla i energii, to bakteria włącza operon i produkuje enzymy, które
posłużą do zużycia laktozy. Dzięki cAMP jest blokowane włączanie operonu laktozowego. cAMP nie pracuje tak długo, jak jest
glukoza. W cały procesie bierze również udział białko CPR, które samo nie może się związać z DNA i aktywować transkrypcji. Glukoza
zmniejsza zawartość cAMP w komórce. Jeśli nie ma glukozy w komórce, to stężenie cAMP wzrasta i CRP wiąże się z cAMP.
Kompleks CRP-cAMP łączy się z promotorem operonu powyżej miejsca wiązania polimerazy RNA. Taki kompleks powoduje wygięcie
cząsteczki DNA pod kątem 90 stopni i jest ona lepiej widoczna, a więc zwiększa się powinowactwo polimerazy RNA do tak zagiętej
cząsteczki.
" Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że polimeraza RNA łączy się z promotorem dużo łatwiej w obecności
specyficznego białka CAP. MIEJCE CAP to miejsce w obrębie promotora.
" Im więcej glukozy tym mniej cAMP (Komórka czerpie z ATP, kiedy nie ma nic prostszego. Dopóki jest glukoza to ATP nie jest
rozkładane). AMP powstaje z ATP przy użyciu cyklazy adenylanowej. Tylko wtedy, gdy poziom glukozy jest bardzo niski. Komórka
zaczyna się ratować energią związaną w ATP.
" Komórka nie traci więc energii na metabolizm laktozy jeśli dostarczy się jej prostszego składnika odżywczego- glukozy.
OPERON TRYPTOFANOWY
" Zawiera pięć genów struktury potrzebnych do syntezy tryptofanu
" Operon stanowi pojedynczą jednostkę transkrypcyjną, wytwarzającą transkrypt. Transkrypt ten jest kodowany przez sekwencje
znajdujące się poniżej POMOTORA i OPERATORA
REPRESOR TRP
" Jest to produkt oddzielnego operonu trpR
" Oddziałuje swoiście z miejscem operatorowym operonu
" Sekwencja OPERATORA, tworząca miejsce wiązania REPRESORA zachodzi na sekwencję promotora w miejscu pomiędzy zasadami -
21 i +3
" Centrum miejsca wiązania jest palindromowe i składa się z 18pz
" REPRESOR wiąże się z tryptofanem i tylko w komplecie z tryptofanem może wiązać się z OPERATOREM.
" Tylko gdy REPRESOR jest związany z tryptofanem, domeny oddziałujące z DNA są dostatecznie od siebie oddalone, a ich boczne
łańcuchy przyjmują odpowiednią konformację, by oddziaływać z dużymi rowkami DNA w obszarze sekwencji OPERATORA trp
" Tryptofan działa jak korepresor i inhibuje swoją własną syntezę
" Represor zmniejsza inicjację transkrypcji
STRUKTURA LIDEROWEGO RNA
" Liderowy odcinek RNA trp złożony jest z 4 regionów o komplementarnej sekwencji.
" Są one zdolne do tworzenia alternatywnych struktur typu spinka do włosów
" Jedna z nich stanowi spinkę terminacyjną- atenuacyjną
PEPTYD LIDEROWY
" Sekwencja liderowego RNA zawiera wydajne miejsce wiązania rybosomu i koduje 14 aminokwasowy peptyd liderowy
" Tryptofan jest kodowany przez 10 i 11 kodon liderowego RNA.
" Gdy w komórce występuje niedobór tryptofanu, rybosom zatrzymuje się na kodonach 10 i 11.
" Funkcja liderowego peptydu polega więc na określaniu stężenia dostępnego tryptofanu i regulowaniu terminacji transkrypcji.
ATENUATOR
" Jest to miejsce znajdujące się przy końcu transkrybowanej sekwencji liderowej
" Poprzedza kodon inicjujący trpE
" Atenuator jest miejscem terminacyjny Rho-niezależnym
" Zawiera krótki rejon palindromowy bogaty w pary G-C, po których następuje 8 cząsteczek U
" Gdy sekwencja ta w transkrypcie RNA utworzy strukturę spinki, działa jak skuteczny terminator transkrypcyjny
ATENUACJA
" Mechanizm zapobiegający nadprodukcji tryptofanu przez komórkę bakteryjną.
" Istotą atenuacji jest ścisłe sprzężenie transkrypcji z translacją
" Pomiędzy sekwencją 1 a 2 występuje kodon STOP.
" W sekwencji pierwszej natomiast znajdują się dwa kodony trp
" Jeśli w komórce bakterii występuje niskie stężenie tryptofanu, to rybosom po przyłączeniu do RNA zatrzymuje się w miejscu
wyznaczonym przez obydwa kodony trp. Rybosom stoi na odcinku UGG i czeka, ale polimeraza nie czeka i transkrybuje kolejne
odcinki sekwencji liderowej. Polimeraza transkrybuje region 2 i 3. One są do siebie komplementarne, bo są stworzone z
palindromów. Rybosom czeka, aż tRNA dostarczy mu tryptofan. W ten sposób blokuje on region 1 i tworzy się spinka do włosów przy
sekwencjach 2:3. Jest to spinka antyterminacyjna. Nie zmienia ona struktury przestrzennej polimerazy i może ona dalej
transkrybować odcinek liderowy. Wchodzi na geny struktury i transkrybuje geny. Geny te z kolei służą do syntezy tryptofanu. Z
transkrypcji 5 genów powstają 3 enzymy.
Autor: Marta Hetman
" Jeśli w komórce jest za dużo tryptofanu, to spinka do włosów tworzy się przy sekwencjach 3:4. Tworzy się spinka terminacyjna, która
zmienia strukturę przestrzenną polimerazy. Ogonek uracylowy pozwala oddysocjować transkryptowi od DNA i kończy się
transkrypcja.
Operony
Kontrola ekspresji genów pozwala organizmom prokariotycznym reagować na zmiany środowiska i produkować jedynie te białka, które są w
danej chwili potrzebne.
Dlatego rozróżniamy białka fakultatywne, dostawcze czyli produkowane w ilościach zależnych od środowiska oraz białka konstytutywne
produkowane w sposób ciągły.
Operon jest to pojęcie zaproponowane po raz pierwszy w 1961 roku przez Jacoba i Monoda. Operon to jednostka prokariotycznej ekspresji
genów, która zawiera koordynacyjnie regulowane geny (geny struktury) i elementy kontrolne, rozpoznawane przez produkty genu
regulatorowego. W skład operonu wchodzą zwykle geny białek powiązanych ze sobą funkcjonalnie.
Wyróżniamy operony:
- indukowany zawiera geny białek szlaków katabolicznych, ich ekspresja jest indukowana przez obecność substratu
- hamowane zawierają geny enzymów szlaków biosyntezy, ich ekspresja jest hamowana przez wzrost stężenia produktu. Produkt
może też kontrolować ekspresję przez atenuację.
Operon laktozowy.
Operon laktozowy (lac) u bakterii E. coli zawiera geny trzech białek niezbędnych dla przyswajania laktozy, jest to:
- lacZ koduje �-galaktozydazę
- lacY koduje permeazę �-galaktozydazową
- lacA koduje transacetylazę �-galaktozydazową
Ekspresja tych białek indukowana jest przez obecność allolaktozy (pochodna laktozy). Represor operonu laktozowego jest białkiem
allosterycznym - to znaczy takim, które może zmieniać swoją strukturę przestrzenną (konformację) pod wpływem przyłączanych czynników
regulacyjnych, czynnikiem tym jest właśnie allolaktoza.
Represor lac jest zbudowany z czterech identycznych podjednostek białkowych. Białko to ma symetryczną strukturę i wiąże się z
palindromową (symetryczną) sekwencją 28 pz DNA operatora O która częściowo pokrywa się miejscem startu transkrypcji genów lacZYA.
lac
Związany represor blokuje transkrypcje kontrolowaną przez promotor Plac.
Region regulatorowy operonu lac zawiera:
- lacI gen kodujący represor operonu lac
- CAP miejsce wiążące białko CAP (catabolite activating protein)
Repersor operonu lac po zamianie konformacji nie jest w stanie wiązać się regionem operatora. Jego odłączenie od operatora umożliwia
przyłączenie się polimerazy RNA do promotora i rozpoczęcie transkrypcji. W ten sposób induktor (laktoza) powoduje derepresję
(odblokowanie) operonu lacZYA i umożliwia ekspresję genów struktury.
Represja kataboliczna operonu lac pozwala na zablokowanie jego ekspresji w obecności glukozy.
Glukoza wywiera wpływ na operon laktozowy i wiele innych genów przez kontrolowanie aktywności cyklazy adenylowej i regulowanie w ten
sposób ilości cAMP w komórce. Białko
aktywatorowe CAP może się przyłączyć do DNA
powyżej promotora lac jedynie w obecności cAMP.
W obecności glukozy poziom cAMP jest niski, a
zatem CAP nie wiąże się z DNA i nie aktywuje
polimerazy RNA. Po zużyciu glukozy poziom cAMP
podwyższa się i umożliwia białku CAP związanie się z
DNA i aktywację transkrypcji operonu lac. Komórka
nie traci tym sposobem energii na metabolizm
laktozy, jeśli w jej otoczeniu znajduje się prostszy
składnik odżywczy.
Operon tryptofanowy
Operon tryptofanowy zawiera pięć genów kodujących białka związane z syntezą tryptofanu. Transkrypcja operonu hamowana jest przez
obecność tryptofanu, który działa jako korepresor. Taki system regulacji pozwala na wykorzystanie tryptofanu zawartego w środowisku bez
straty energi na tworzenie tryptofanu endogennego. Jest to rodzaj operonu anabolicznego (hamowanego).
Autor: Marta Hetman
W operonie trp zachodzi zjawisko atenuacji (osłabienia) polega ono na kontroli transkrypcji przez translacje. Cechą operonów anabolicznych
jest rozpoczynanie się od sekwencji liderowej, kodującej peptyd liderowy. Peptyd ten jest bogaty w aminokwas, który będzie syntetyzowany
przez enzymy wytworzone dzięki danemu operonowi. Transkrypcja sekwencji liderowej operonu trp może być zainicjowana pomimo obecności
tryptofanu. W obrębie sekwencji liderowej znajduje się sekwencja zwana atenuatorem. Atenuator, o długości 162 pz, poprzedza kodon
inicjujący trp E. Zawiera on krótki rejon palindromowy, bogaty w pary G-C po którym następuje 8 kolejnych cząsteczek U. Gdy sekwencja ta w
transkrypcie RNA utworzy strukturę spinki, działa ona jako terminator transkrypcji i powstaje wówczas krótszy transkrypt. Przy obecności
dużych stężeń tryptofanu synteza mRNA kodującego ten aminokwas jest przerywana po utworzeniu nici o długości 140 nukleotydów.
Poprzez różne tempa zachodzenia transkrypcji i translacji w obecności (lub przy niskim stężeniu) tryptofanu struktura spinki do włosów jest
tworzona albo przez regiony 3 i 4 albo przez regiony 2 i 3.
Regiony atenuacji obecne są także w sekwencjach operonów odpowiedzialnych za produkcję:
" Treoniny
" Histydyny
" Leucyny
" Fenyloalaniny
Ilość kodonów odnoszących się do obecności aminokwasu, którego synteza jest regulowana, jest różna w przypadku różnych operonów.
Autor: Marta Hetman

Wyszukiwarka