5194416436
Labelling Kit Roche
Wykonanie
Przygotować roztwór DNA, który ma zostać wyznakowany:
3ul DNA do znakowania (0,5 - 3 ug)
12 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100°C przez 10 minut) wstawić do lodu na 2 minuty a następnie dodać pozostałe składniki mieszaniny reakcyjnej:
2ul mieszaniny heksanukleotydów
2ul mieszaniny nukleotydów zawierającej DIG-ll-dUTP
lul enzymu Klenowa
Mieszaninie inkubować w temperaturze 37°C przez 60 minut. Następnie zatrzymać reakcję dodając 2ul 0,2M EDTA (pH 8,0). Teraz należy usunąć pozostałe w reakcji w wyznakowane nukleotydy. W tym celu dodać do reakcji 1/10 objętości 4M LiCl i 3 objętości zimnego (-20°C) etanolu 96%. Wymieszać i umieścić na 30 minut w temperaturze —20°C. Żwirować w mikrowirówce przez 15 minut. Usunąć supematant a osad przepłukać 70% etanolem, wysuszyć i zawiesić w 50ul buforu TE.
Hybrydyzacja
Jeśli sonda jest w 100% homologiczna do poszukiwanego DNA, hybrydyzację należy prowadzić w 65°C.
- prehybrydyzację prowadzić w 65°C co najmniej przez 2 godziny:
roztwór do prehybrydyzacji:
0,25M Na2HP04 (pH 7,2)
ImM EDTA 20% SDS
0,5% odczynnik blokujący,
- po zakończeniu prehybrydyzacji wymienić roztwór na nową porcję zawierającą wyznakowaną sondę.
- hybrydyzację prowadzić przez noc w temperaturze 68°C,
- po hybrydyzacji płukać filtr 3 razy w temperaturze 68° C w roztworze zawierającym:
20mM Na2HP04 ImM EDTA 1% SDS
-następnie przepłukać krótko w temperaturze pokojowej buforem do płukania II:
0,1 M kwas maleinowy (pH 8,0)
3M NaCl 0,3% Tween20
Wywołanie
Przeciwciała skierowanie przeciwko digoksygeninie sko-niugowane z alkaliczną fosfatazą rozcieńczyć w stosunku 1:10 000 w buforze blokującym (bufor do płukania II plus 0,5% odczynnik blokujący). Przygotować 10 ml powyższego roztworu na jedną membranę. Membranę inkubować przez 1 godzinę mieszając a następnie przepłukać trzy razy buforem do płukania II.Membranę zrównoważyć w buforze substratów)™ dla alkalicznej fosfatazy (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCb). Dodać po 20pl substratów kolorymetrycznych (NBT i BCIP) do 10 ml buforu substratowego. UWAGA - substraty są toksyczne. Czekać na pojawienie się prążków.
ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką powszechnie stosowaną w analizie białek.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym - typ SDS PAGE służy do rozdziału białek ze względu na ich wielkość, wykluczając inne właściwości fizykochemiczne poli-peptydów.
Jeśli zrozumiesz nazwę SDS PAGE, zrozumiesz zasadę działania tej metody rozdziału białek.
SDS
Wiadomo, że na prędkość poruszania się obiektu w środowisku wpływa zarówno jego wielkość jak i kształt. Jeśli chcemy rozdzielić mieszaninę białek, które różnią się między sobą kształtem i wielkością, przede wszystkim chcemy uzyskać warunki, w których poszczególne cząsteczki białkowe zostaną pozbawione swojej drugo-, trzecio- i czwartorzędowej struktury (chcemy, aby wszystkie polipeptydy miały ten sam liniowy kształt). Aby nadać wszystkim białkom ten sam liniowy kształt używamy SDS-u (siarczan dodecylu sodu, ang. Sodium Dodecyl Sulfate). SDS jest detergentem, który rozpuszcza hydrofobowe cząsteczki i jednocześnie posiada ujemny ładunek. W związku z tym, jeśli przeprowadzimy inkubację komórki w roztworze SDS-u, błony komórkowe zostaną rozpuszczone, a zdenaturowane białka zostaną pokryte ujemnymi ładunkami. Po zadziałaniu SDS wszystkie białka będą posiadały jedynie strukturę pierwszorzędową, oraz wszystkie cząsteczki będą ujemnie naładowane, co po przyłożeniu pola elektrycznego spowoduje ich migrację w stronę dodatniego bieguna.
PAGE
Jeśli zdenaturowane białka umieścimy w polu elektrycznym wszystkie przemieszczą się w stronę dodatniego bieguna z tą samą prędkością, niezależnie od swojej wiel-
Aby białka mogły poruszać się z prędkością zależną od wielkości cząsteczki rozdziela się je w poliakrylamidzie, który jest polimerem zbudowanym z monomerów akry-lamidowych. W trakcie polimeryzacji, monomery akryla-midowe tworzą żel poliakrylamidowy, który staje się środowiskiem rozdziału białek po przyłożeniu pola elektrycznego, stąd nazwa — ang. PolyAcrylamide Gel Elec-trophoresis (PAGE). Poliakrylamid zbudowany jest z sieci labiryntów o korytarzach różnej średnicy. W tak skonstruowanym środowisku małe cząsteczki szybciej osiągną dodatni biegun niż większe cząsteczki białka.
Ten typ elektroforezy jest obecnie najczęściej stosowany i może być użyty jako oddzielna metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych, bardziej skomplikowanych badań (np. elektroforeza dwuwymiarowa, prepara-tywna, Western blotting).
Standardowo SDS PAGE jest używana w wersji tzw. disc eledrophoresis (ang. discontinuouspH), umożliwiającej maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce ta „nieciągłość” dotyczy zarówno żelu, który
15
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
została jak najprawdziwsza przygoda kilkuletniego Tolika, który wybrał się na wakacje z mamą do cioc
CCF20081129 059 o pewien typ wypowiedzi, który ma odnosić się w określony sposób do widzialnej rzecz
89553 skanuj0184 (7) 196 PHP i MySQL dla każdego Parametr nazwa to ciąg znaków, wskazujący nazwę pli
W otwartym oknie sterownika Windows, po lewej stronie, wybieramy rodzaj obrazu, który ma zostać zesk
s 129 129 Wykonanie ćwiczenia W zlewkach o pojemności 100 ml przygotować roztwory zawierające jodan
s 129 129 Wykonanie ćwiczenia W zlewkach o pojemności 100 ml przygotować roztwory zawierające jodan
IV Wykonanie ćwiczenia 1. Przygotowanie roztworów wzprconych. Do 7 kolb miarowych
s 129 129 Wykonanie ćwiczenia W zlewkach o pojemności 100 ml przygotować roztwory zawierające jodan
P1050841 Wykonanie oznaczenia. Przygotowanie roztworów wzorcowych. Do 7 kol bek o pojemności 50 ml w
Wykonano również przestrzenny goniometr, który służył do rejestracji położenia kończyny górnej
na tym, że do rozpoczęcia PCR niezbędna jest znajomość początkowego i końcowego fragmentu DNA, który
skan077 (2) ?. i Przygotować roztwór chlorku sodowego o znanym stężeniu procentowym. W tym celu zważ
IMG83 (16) Przygotowany roztwór umieszcza się w specjalnej szklanej probówce o średnicy zewnęt
208 3 416 Informacja do zadań 169.-170. Przygotowano roztwory wodne następujących substancji: fenol,
więcej podobnych podstron