7368841144

Zakład Biologii Molekularnej UMCS, luty 2015

Elektroforeza 2D jako narzędzie w diagnostyce chorób genetycznych

Elektroforeza dwukierunkowa (dwuwymiarowa) 2D (ang. two-dimentional) jest powszechnie stosowaną techniką rozdziału białek badanego proteomu. Metoda ta pozwala na wykrycie zmian w ekspresji białek, ich izoform czy modyfikacji potranslacyjnych (takich jak fosforylacja, glikozylacja czy ograniczona proteoliza). Składa się z dwóch etapów. Pierwszym etapem (kierunkiem, wymiarem) jest ogniskowanie izoelektryczne (IEF), w którym białka są rozdzielane w gradiencie pH w zależności od ich punktu izoelektrycznego (pi). W ogniskowaniu izoelektrycznym stosowane są komercyjne paski żeli z immobilizowanym gradientem pH gwarantującym wysoką rozdzielczość i powtarzalność uzyskanych wyników, bądź kapilary z żelem poliakrylamidowym z określonym gradientem pH. Drugim etapem (kierunkiem, wymiarem) jest elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS/PAGE) w której białka są rozdzielane zgodnie z ich masą cząsteczkową. W wyniku rozdziału białek metodą elektroforezy 2D, a następnie wybarwienia uzyskanego żelu (najczęściej stosowanymi barwnikami są - błękit Coomassie Brillant Blue oraz sole srebra) otrzymujemy „mapę białkową” składającą się z wielu plam, z których każda stanowi białko o określonych parametrach masy cząsteczkowej i punktu izoelektrycznego. Porównanie takich map pochodzących z komórek zdrowego i chorego organizmu może nam dostarczyć wiele informacji na temat białek charakterystycznych dla danej choroby, które potencjalnie mogą się stać nowymi markerami choroby. Dodatkowo, niektóre z tak wykrytych białek mogą stać się celem terapeutycznym. Mimo wielu zalet, metoda ta ma pewne ograniczenia. Dużą trudność sprawia uzyskanie profilu białkowego charakterystycznego dla całego proteomu, ponieważ białka występujące w komórce różnią się rozpuszczalnością. Na przykład, białka błonowe, hydrofobowe oraz o wysokiej masie cząsteczkowej mogą nie zostać wykryte przy zastosowaniu mocznika, który jest typowym składnikiem roztworów, w których przeprowadza się elektroforezę. Innym problemem jest wykrycie białek występujących w badanej próbce białkowej w bardzo niskich stężeniach. Jest to o tyle poważne ograniczenie, gdyż wiele białek regulatorowych, sygnałowych czy czynników transkrypcji, ważnych z punktu widzenia diagnostyki i prognostyki chorób, występuje w niskich stężeniach. Najprostszym sposobem na wyeliminowanie tych ograniczeń jest wstępne frakcjonowanie badanej próby. Kolejnym problemem jest uzyskanie odpowiedniej