Konspekt wykładu 5

I. TRANSPORT

Błonowe białka transportowe (transportery albo permeazy) to integralne białka błonowe. Tworzą kanały, przez które są pobierane różne związki pokarmowe, albo przez które są wydalane z komórki np. metabolity wtórne. Niektóre przenoszą tylko jeden określony rodzaj cząsteczki, inne biorą udział w przenoszeniu określonej klasy cząsteczek, np. określonej grupy cukrów, czy spokrewnionych aminokwasów.

Systemy transportu E. coli :

1. Ułatwiona dyfuzja - zachodzi wyłącznie zgodnie z gradientem stężeń

Przykład: transport glicerolu u E. coli

2 Systemy transportu aktywnego

- transport wbrew gradientowi stężeń

- zachodzi z wykorzystaniem energii, np. gradientów protonów i jonów sodu, ATP

- cząsteczki transportowane nie są modyfikowane

3. Translokacja grupowa.

- cząsteczka transportowana ulega zmianie w czasie transportu;

- w procesie wydatkowana jest energia;

- najlepiej poznany jest system fosfotransferazowy.

Trzy klasy białek transportowych:

a) Uniportery, które przenoszą w tym samym czasie jeden rodzaj cząsteczki z jednej strony błony na drugą;

b) Symportery, które przenoszą dwa rodzaje cząsteczek w tym samym kierunku; bardzo często cząsteczką ko-transportowaną jest proton;

c) Antyportery, które przenoszą dwa rodzaje związków w przeciwnych kierunkach.

E. coli wykorzystuje symport protonowy do pobierania np. laktozy, różnych aminokwasów i kwasów organicznych, takich jak bursztynian i jabłczan. Glutaminian i cukier melibiozę pobiera w wyniku symportu sodowego.

Systemy transportu ABC występują zarówno u prokariotów (bakterie i archeony) jak i u eukariotów. Składają się z: 1) białka wiążącego, leżącego na zewnątrz błony komórkowej, które przyłącza transportowany substrat; 2) kompleksu białek błonowych, stanowiących właściwy transporter; jedno z nich zawiera domenę wiążącą ATP, skąd pochodzi nazwa systemu (ang. ATP-binding cassette). Hydroliza ATP dostarcza energii do transportu.

U E. coli transport: różnych cukrów, jonów, aminokwasów, kwasów organicznych i oligopeptydów, np. transport maltozy zachodzi z udziałem systemu ABC, złożonego z peryplazmatycznego białka wiążącego MalE, białek błonowych MalF i MalG, oraz 2 cząsteczek białka ABC - MalK. Poryna LamB uczestniczy w transporcie maltozy ze środowiska do przestrzeni peryplazmatycznej.

3. Translokacja grupowa - proces transportu, w którym przenoszona przez błonę substancja ulega chemicznej modyfikacji i w takiej zmienionej formie pojawia się w cytoplazmie. Najlepiej poznany - system fosfotransferazowy, zwany systemem PTS (ang. phosphotransferase system), który występuje u wielu prokariotów. Nie występuje u eukariotów. U E coli uczestniczy w przenoszeniu cukrów, np. glukozy, fruktozy, sacharozy, które są fosfoforylowane w czasie transportu. W transporcie glukozy uczestniczy 5 białek (cytoplazmatycznych i błonowych), które biorą udział w przeniesieniu wysokoenergetycznej grupy fosforanowej z fosfoenolopirogronianu (PEP) na białko błonowe, które fosforyluje cukier i jednocześnie przenosi go do cytoplazmy.

Kilka różnych systemów do transportu określonej cząsteczki, co umożliwia lepsze przystosowanie do zmieniających się warunków środowiska (każdy z nich może być w inny sposób napędzany, inne powinowactwo do substratu, itp.). Np. E. coli ma: 5 różnych systemów transportu galaktozy; 3 różne systemy transport glutaminianu; 2 różne systemy transportu potasu

Pobieranie żelaza - udział syderoforów, niskocząsteczkowych związków, które tworzą kompleksy z jonami Fe³⁺. E. coli wytwarza syderofor zwany enterobaktyną (=enterocheliną).

Eksport i sekrecja białek

W procesach tych uczestniczą translokazy. Najważniejszy system przemieszczania białek to system Sec (ang. secretory system). Translokaza SecYEG, występująca u wielu prokariotów i uczestniczy w przenoszeniu wielu różnych białek. Inne translokazy są bardzo specyficzne.

Znane są 4 typy sekrecji białek, w tym dwa są niezależne od systemu Sec.

II KATABOLIZM

W cytoplazmie niektóre z pobranych związków odżywczych muszą zostać poddane dalszej obróbce, zanim będą mogły wejść w szlaki degradacyjne, takie jak glikoliza, albo zanim będą mogły zostać wykorzystane w reakcjach biosyntezy.

Dwucukry (sacharoza, maltoza, laktoza, celobioza) zostają rozłożone do monomerów. Cukry proste ulegają różnym przekształceniom (np. fosforylacji, izomeryzacji, utlenieniu, redukcji, usunięciu podstawników) i są kierowane do głównych szlaków degradacyjnych. Aminocukry, np. N-acetyloglukozoamina (składnik chityny i mureiny) ulegają deacetylacji i/lub deaminacja i powstaje fruktozo-6-fosforan.

Pentozy wchodzą w skład hemiceluloz (ksyloza, arabinoza), oraz kwasów nukleinowych (ryboza i deksyryboza). Są pobierane z udziałem permeaz, a następnie przekształcane w ksylulozo-5-fosforan, który może wejść do oksydatywnego cyklu pentozofosforanowego.

Aminokwasy - deaminacja, a powstający kwas organiczny może zostać przekształcony w pirogronian, acetylo-CoA, lub związek pośredni cyklu Krebsa. Związki te mogą następnie zostać utlenione w cyklu Krebsa, bądź mogą zostać wykorzystane jako źródło węgla w reakcjach biosyntezy składników komórkowych..

Glicerol po odpowiednim przekształceniu wchodzi do glikolizy, a kwasy tłuszczowe są często utleniane w wyniku -oksydacji do acetylo-CoA, który wchodzi do cyklu Krebsa.

Najważniejsze szlaki rozkładu cukrów:

Glikoliza (szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa, szlak EMP)

glukoza + 2ADP + 2Pi + 2NAD⁺ → 2pirogronian + 2ATP + 2NADH⁺ + 2H⁺

Szlak heksozomonofosforanowy HMP (cykl pentozofosforanowy)

2) działa w warunkach tlenowych i beztlenowych;

glukozo-6-fosforan + 12 NADP⁺ + 7 H₂O → 6 CO₂ + 12 NADPH + 12H⁺ + + Pi

Szlak Entnera-Doudoroffa

Fermentacje

a) gazy (CO₂, H₂); b) kwasy organiczne (mrówczan, octan, mleczan, bursztynian i inne); c) alkohole (etanol, glicerol, 2,3-butanediol); d) ketony (np. aceton); e) inne (np. acetoina, diacetyl).

Najbardziej powszechne substraty fermentacji to heksozy i pentozy, które zostają przekształcone w pirogronian, np. w glikolizie lub w szlaku Entnera-Doudoroffa. Bakterie przeprowadzające fermentacje są warunkowymi tlenowcami (np. Enterobacteriaceae) bądź beztlenowcami (np. bakterie mlekowe, klostridia).

Rodzaje fermentacji

1. Fermentacja homomlekowa

glukoza → mleczan

- końcowy akceptor - pirogronian; bakterie mlekowe (np. Lactococcus lactis).

2. Fermentacja heteromlekowa.

glukoza → CO₂ + mleczan +etanol

- końcowe akceptory - pirogronian i aldehyd octowy; bakterie mlekowe (np. Lactobacillus brevis)

3. Fermentacja alkoholowa.

glukoza → 2CO₂ + etanol

- końcowy akceptor - aldehyd octowy; drożdże, Zymomonas

4. Fermentacja kwasów mieszanych

E. coli:    glukoza → mleczan +etanol + bursztynian + CO₂ + H₂

- końcowe akceptory - różne; Enterobacteriaceae (Escherichia, Proteus, Salmonella i Shigella).

5. Fermentacja masłowa.

- jeden z produktów - kwas masłowy; klostridia (np. Clostridium butyricum, C. pasteurianum, C. perfringens).

6. Fermentacja acetonowo-butanolowa.

- produktami są m.in. aceton (lub izopropanol) i n-butanol; klostridia

7. Fermentacja propionowa.

produktem jest m.in. kwas propionowy; Propionibacterium, klostridia

Fermentacje substratów innych niż cukry

1) Fermentacja aminokwasów (reakcja Sticklanda)

    Jeden aminokwas jest utleniany, a drugi jest końcowym akceptorem elektronów i ulega     redukcji. Przeprowadzan przez różne klostridia, np. C. botulinum.

2) Fermentacja kwasów organicznych, takich jak octan mleczan, cytrynian, propionian)

    Np. produktem fermentacji cytrynianu przez Leuconostoc citrovorum jest diacetyl, który     nadaje przyjemny zapach i smak wyrobom mlecznym, np. masłu.

Wykorzystanie fermentacji

1. Fermentacja warzyw i owoców - sposób konserwowania i nadania pożądanych walorów smakowych i zapachowych z wykorzystaniem mikroorganizmów występujących w tych produktach (np. kiszenie ogórków, kapusty).

2. Produkcja kiszonek dla zwierząt.

3. Produkcja serów i fermentowanych napojów mlecznych - z wykorzystaniem specyficznych mikroorganizmów (hodowle starterowe).

Śmietana: Lactococcus lactis lub L. cremoris oraz nadające zapach Leuconostoc citrovorum lub L. dextranicum (wytwarzają diacetyl)

Jogurt: Lactococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus

Kefir: Lactococcus lactis, L. bulgaricus, drożdże fermentujące laktozę (bakterie wytwarzają 0,6 - 1% kwasu mlekowego, a drożdże 0,5 - 1% etanolu).

Sery dojrzewajace: 1) wytrąca się kazeinę enzymatycznie (renina), szczepi odpowiednimi bakteriami;   miesza się i ogrzewa do temp. 40-55^oC (w zależności od sera); 2) oddziela się krzep od serwatki, 3) nadaje kształt i inkubuje w odpowiedniej temperaturze. Bakterie z rodzaju Lactotococcus i Lactobacillus wytwarzają kwas i zapach,   natomiast z rodzaju Propionibacterium charakterystyczny zapach i dziury.

Cykl kwasu cytrynowego

(cykl Krebsa, cykl kwasów trikarboksylowych) - centralna rola w metabolizmie zarówno eukariotów, jak i wielu bakterii.

Do cyklu wchodzi jednostka dwuwęglowa acetylo-koenzym A, powstający np. w czasie glikolizy. Ulega on kondesacji ze szczawiooctanem, w wyniku czego powstaje cytrynian, skąd bierze się jedna z nazw tego cyklu. W następujących po sobie kolejnych reakcjach wchodząca do cyklu grupa acetylowa zostaje całkowicie utleniona. W wyniku jednego obrotu cyklu: 1) uwalniane są dwie cząsteczki CO₂, 2) zredukowane zostają 3 cząsteczki NADP lub NAD i jedna FAD, 3) zsyntetyzowana zostaje jedna cząsteczka ATP (lub GTP) w wyniku fosforylacji    substratowej; 4) zregenerowana zostaje jedna cząsteczka szczawiooctanu. NADPH (lub NADH) i FADH₂ mogą zostać utlenione w łańcuchu oddechowym, dostarczając ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej. Cykl jest ważnym dostarczycielem NADPH i prekursorów do reakcji biosyntez.

Metylotrofia 

(wykorzystanie związków C1 (innych niż CO₂) jako źródła węgla i energii)

Związki C1 - bardziej zredukowane niż CO₂, nie zawierają wiązań węgiel-węgiel:, np. metan (CH₄), metanol (CH₃OH), aldehyd mrówkowy (CH₂O), mrówczan (HCOO^-), metyloamina (CH₃NH₂), metylomerkaptan (CH₃-SH) i inne.

Podział metylotroów (mikroorganizmów zdolnych do wzrostu na związkach C1)

Metanotrofy:

- szlak rybulozomonofosforanowy (ang. ribulose monophosphate pathway, RMP)

- szlak serynowy.

Symbioza bakterii metanotroficznych z małżami i gąbkami morskimi, żyjącymi w pobliżu wycieków węglowodorów z dna morskiego (ang. hydrocarbon seeps), gdzie uwalniany jest metan. (np. w Zatoce Meksykańskiej). Bakteryjne symbionty znajdują się w wakuolach w komórkach skrzeli małża. Dostarczają gospodarzowi związków organicznych syntetyzowanych w wyniku metabolizowania metanu.

Oddychanie

1) utlenianie związków organicznych bądź nieorganicznych;

2) synteza ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej, z udziałem łańcucha transportu elektronów i siły protonomotorycznej (ang. protonmotive force, PMF);

3) wykorzystanie egzogennych końcowych akceptorów elektronów (u prokariotów - tlen, inne pierwiastki bądź związki nieorganiczne i organiczne).

Fosforylacja oksydacyjna i łańcuch oddechowy

Łańcuch transportu elektronów to zespół przenośników elektronów, które przenoszą elektrony z NADH + H⁺ lub z FADH₂ na egzogenne akceptory. Elektrony przepływają od przenośników o niższym potencjale redoks do przenośników o bardziej dodatnim potencjale. Ostatecznym ich akceptorem jest np. tlen i powstaje woda. Zgodnie z hipotezą chemiosmotyczną Petera Mitchella, w czasie transportu elektronów w łańcuchu oddechowym, protony są pompowane na zewnątrz błony komórkowej. Powstaje w ten sposób gradient protonów i potencjał błonowy, zwane siłą protonomotoryczną (ang. protonmotive force, PMF). Kiedy protony wracają do wnętrza komórki, syntetyzowany jest ATP.

Łańcuchy transportu elektronów występujące u organizmów prokariotycznych różnią się od łańcuchów organizmów eukariotycznych:

Podział prokariotów na podstawie zapotrzebowania na tlen

1) Tlenowce:

   a) bezwzględne - wymagają tlenu do wzrostu i rosną w standardowej atmosferze       powietrza (21% tlenu);

   b) względne - lepiej rosną w obecności tlenu, lecz nie wymagają go bezwzględnie;

Przykład: Escherichia coli

   c) mikroaerofile - wymagają tlenu, lecz nie tolerują tak wysokiego stężenia tlenu, jakie jest    w powietrzu (21%). Lepiej rosną, gdy stężenie tlenu wynosi 1 - 15%. Przykłady: Campylobacter jejuni (5% tlenu), Magnetospirillum magnetotacticum.

2) Beztlenowce (nie wykorzystują tlenu i na ogół nie rosną w atmosferze tlenowej):

a) aerotolerancyjne - tolerują niskie stężenia tlenu;

Przykład: Clostridium perfringens, bakterie mlekowe.

b) bezwzględne (ścisłe) - nawet krótka ekspozycja na tlen jest dla nich letalna;

   Przykład: bakterie i archeony redukujące siarczany, bakterie homoacetogenne i    archeony metanogenne.

Wśród mikroorganizmów prokariotycznych metabolizm beztlenowy jest bardzo powszechny i niezwykle zróżnicowany. Wiele bakterii ma łańcuchy oddechowe, które mogą działać z wykorzystaniem innych niż tlen, zarówno organicznych jak i nieorganicznych egzogennych akceptorów elektronów. W oddychaniu beztlenowym powstaje mniej ATP niż wtedy, gdy tlen jest końcowym akceptorem..

Oddychanie beztlenowe

1) Oddychanie azotanowe (redukcja dysymilacyjna azotanu)

Bakterie zdolne do oddychania azotanowego to warunkowe tlenowce (tlen jest preferowanym przez nie akceptorem elektronów). Dopiero gdy nie ma tlenu w środowisku, a jest azotan, dochodzi do syntezy reduktazy azotanowej, która zastępuje oksydazę cytochromową w łańcuchu transportu elektronów i przenosi elektrony z cytochromu na azotan, redukując go do azotynu.

NO₃^- + 2e^- + 2H⁺ → NO₂^- + H₂O

Reduktaza azotanowa to enzym błonowy, którego synteza jest hamowana przez tlen. Wszystkie pozostałe reduktazy (azotynowa, tlenku azotu itd.) są regulowane w sposób skoordynowany, więc są również hamowane przez tlen, a obecność azotynów jest potrzebna, by enzymy te uległy pełnej ekspresji. Reduktaza azotanowa przenosi elektrony z cytochromu na azotan.

Łańcuch oddechowy w oddychaniu azotanowym jest krótszy niż w oddychaniu tlenowym, stąd mniejszy zysk energetyczny.

Denitryfikacja: proces oddychania azotanowego, w którym powstają produkty gazowe (N₂O i N₂). Skutki denitryfikacji to: 1) zubożenie środowiska w związki azotu; 2) kwaśne deszcze (N₂O jest przekształcany przez światło słoneczne w NO, który reaguje z ozonem w górnych warstwach atmosfery, w wyniku czego powstają azotyny; 3) utrata ozonu potęguje efekt szklarniowy.

Denitryfikatory: np. Paracoccus, Pseudomonas (Proteobacteria); niektóre bakterie gramdodatnie, np. niektóre gatunki Bacillus i Streptomyces.

Oddychanie azotanowe E. coli.

1. Reduktaza azotanowa:

NO₃^- + 2e^- + 2H⁺ → NO₂^- + H₂O

2. Amonifikacja azotynów z wykorzystaniem NAD(P)H jako dawcy elektronów.

NO₂^- +3NAD(P)H + 5H⁺ → NH₄⁺ + 3NAD(P) + 2H₂O

Amonifikacja: 1) nie jest sprzężona z uzyskiwaniem energii; 2) bakteria „oszczędza” w ten sposób azotany, które może wykorzystywać jako ostateczne akceptory w łańcuchu oddechowym; 3) pozbywa się toksycznych azotynów.

2) Oddychanie siarczanowe (dysymilacyjna redukcja siarczanów)

Bakterie redukujące siarczany

1. grupa fizjologiczna, nie taksonomiczna;

2. bezwzględne beztlenowce wykorzystujące siarczany jako ostateczne akceptory elektronów:

SO₄^2- + 8e + 8H⁺ → S^2- + 4H₂O

3. żyją w osadach dennych, w ściekach zanieczyszczonych związkami organicznymi, w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, np. przeżuwaczy.

4. ich nazwy zaczynają się od przedrostka Desulfo-, np. różne gatunki Desulfovibrio, Desulfotomaculum.

Archeony redukujące siarczany np. Archaeoglobus sp.

3) Oddychanie węglanowe

4) Oddychanie żelazowe

W wielu osadach najbardziej obfitym akceptorem elektronów jest żelazo(III). Do oddychania żelazowego zdolne są bakterie z różnych grup taksonomicznych, a także archeony. Być może redukcja Fe(III) była jedną z pierwszych form oddychania mikroorganizmów. Potwierdza to znalezienie nowego hipertermofilnego archeona, (nazwanego tymczasowo szczepem 121), który rośnie w 85-121^oC, w warunkach beztlenowych z mrówczanem i Fe(III) i powoduje redukcję żelaza (Science, 2003, vol. 301, str. 934).

5) Oddychanie z wykorzystaniem innych związków jako egzogennych akceptorów

1. Tlenek trimetyloaminy (bezwonny) wytwarzany przez morskie ryby. Redukowany do trimetyloaminy, która charakteryzuje się intensywnym zapachem.

2. Dimetylosulfotlenek (DMSO) w wodzie morskiej (pochodzi z dimetylosulfopropionianu, wytwarzanego przez morskie glony). DSMO jest redukowany do siarczku dimetylu (DMS), który ma silny, odrażający zapach.

W środowisku - sukcesja mikroorganizmów, jeśli dostępne są różne końcowe akceptory elektronów. Najpierw wykorzystywany jest tlen, potem azotany,. a gdy ich nie ma, będą się rozwijały bakterie wykorzystujące żelazo. Potem będą ze sobą współzawodniczyły bakterie redukujące siarczany i metanogenne archeony. Zwykle najpierw dominują te pierwsze, gdyż rosną szybciej od metanogenów. Gdy zabraknie siarczanów, metanogeny dominują w siedlisku.

Tabela 1. 

Oddychanie beztlenowe prokariotów