IV. MIKROSKOP. TECHNIKA MIKROSKOPOWANIA

Podstawowym przyrządem stosowanym w badaniach mikrobiologicznych jeśli mikroskop. Rozróżnia się wicie typów mikroskopów w zależności od sposobu wykorzystania promieni świetlnych i długości promieni użytych do mikroskopowania. We wstępnych analizach mikrobiologicznych najczęściej używanym mikroskopem jest mikroskop optyczny zwykły.

Mikroskop optyczny : a - okular w nasadce okularowej, b - tubus, c - statyw, d - obiektyw, e - śruba makrometryczna, f - śruba mikrometryczna, g - zmieniacz obiektywów, h - stolik, i - kondensor, j - podstawa z oświetleniem

Budowa mikroskopu

Mikroskop składa się z części mechanicznych i części optycznych, czyli układu optycznego. Obie te części połączone są w funkcjonalną całość.

Części mechaniczne Stanowią one rusztowanie dla układu optycznego. Do elementów mechanicznych mikroskopu należą:

> Podstawa Wyposażona jest w źródło światła i odpowiada za stabilność przyrządu.

> Statyw Łączy wszystkie elementy mikroskopu w całość.

> Tubus Składa się z nasadki okularowej, głowicy i zmieniacza obiektywów tzw. zmieniacza rewolwerowego.

> Mechanizmy ruchu

Śruba makrometryczna (mechanizm zgrubny) służąca do szybkiego znalezienia obrazu.

Śruba mikromelryczna (mechanizm ruchu drobnego) służąca do wyregulowania ostrości obrazu

Śruba do przesuwania aparatu oświetlającego, znajdującego się pod stolikiem przedmiotowym.

> Ruchomy stolik przedmiotowy Umieszcza się na nim preparaty umocowane za pomocą specjalnych zacisków. W środku stolika znajduje się otwór przez który przechodzą promienie świetlne.

Części optyczne Do tych części zalicza się okulary, obiektywy i aparat oświetlający.

> Okulary Zbudowane są z zespołu, powiększających na zasadzie lupy, soczewek płasko - wypukłych. Górna soczewka, nazywana oczną, stroną płaską zwrócona jest do gałki ocznej, natomiast soczewka dolna, polowa, zwana często kolektywem, skierowana jest w stronę obserwowanego przedmiotu. W mikroskopach optycznych najczęściej stosuje się okulary Huygensa.

> Obiektywy Są układem kilku do kilkunastu soczewek skupiających, sklejonych i umieszczonych współosiowo w metalowej oprawie. Najbardziej zewnętrzna soczewka nazywa się soczewką czołową.

Układ soczewek ma na celu utworzenie wyraźnego obrazu oraz usunięcie niektórych wad soczewek, np. aberracji sferycznej i aberracji chromatycznej. W związku z czym wyróżnia się kilka typów obiektywów. Do najważniejszych z nich należą: achromatyczne, półachromatyczne (fluorytowe) i apochromatyczne. Te ostatnie są obiektywami najwyższej jakości, gdyż charakteryzują się bardzo wysokim stopniem korelacji wad soczewek.

Obiektywy różnią się również siłą powiększającą. Obiektywy suche charakteryzują się mniejszym i średnim powiększeniem, a obiektywy imersyjne, tzn. takie, gdzie do oglądania preparatu używa się olejku cedrowego (imersyjnego), największym.

Na oprawce obiektywu zaznaczone są najistotniejsze parametry -- powiększenie i apertura numeryczna obiektywu.

> Aparat oświetlający zwany aparatem Abbego W starszym typie mikroskopów urządzenie oświetlające składało się ze źródła światła, lusterka, kondensora i przysłony irysowej. Obecnie źródło światła zaopatrzone w matówkę i przesłonę wmontowane jest w podstawę mikroskopu. Aparat oświetlający umieszczony pod stolikiem przedmiotowym składa się z kondensora zbudowanego z dwóch soczewek silnie skupiających światło na preparacie i przesłony irysowej, która reguluje ilość promieni świetlnych wpadających do kondensora. Za pomocą specjalnej śruby kondensor można przesuwać pionowo.

Zasada działania mikroskopu Preparat umieszcza się na stoliku. Promienie świetlne ze źródła światła kierowane są, poprzez przysłonę irysową, wprosi do kondensora. Po przejściu przez kondensor skupiają się na preparacie oświetlając go; stąd trafiają do obiektywu, który powiększa badany obiekt, dzięki czemu w obiektywie powstaje obraz rzeczywisty, powiększony i odwrócony. W okularze obraz wytworzony w obiektywie jest tylko powiększany, w wyniku czego otrzymuje się obraz powiększony, prosty i pozorny.

Rola olejku immersyjnego Promienie świetlne po przejściu przez preparat wchodzą do ośrodka optycznie rzadszego (powietrze) i ulegają w nim częściowo rozproszeniu i załamaniu, ponieważ w przypadku stosowania obiektywów suchych przestrzeń między preparatem a obiektywem wypełniona jest powietrzem. Otrzymany obraz może być mniej wyraźny, gdyż część promieni w ogóle nie trafia do soczewki czołowej obiektywu. W przypadku obiektywów imersyjnych przestrzeń robocza wypełniona jest olejkiem cedrowym, którego współczynnik załamania światła jest zbliżony do współczynnika załamania światła w szkle i dlatego wszystkie promienie przechodzące przez preparat trafiają do soczewki czołowej obiektywu. Powstały obraz jest wyraźny i jasny.

Podstawowe wielkości charakteryzujące mikroskop Podstawowymi wielkościami charakteryzującymi mikroskop są powiększenie mikroskopu i zdolność rozdzielcza.

> Powiększenie mikroskopu Jest to iloczyn powiększenia obiektywu i okularu. Na oprawkach obiektywu i okularu wygrawerowane są liczby, oznaczające wielkość powiększenia. Przy stosowaniu mikroskopów, które są wyposażone w nasadką dwuoczną całkowite powiększenie mikroskopu równe jest iloczynowi powiększenia obiektywu, okularu i nasadki dwuocznej. Powiększenie mikroskopu można również obliczyć ze wzoru na soczewki, przyjmując, że obiektyw i okular to soczewki pojedyncze.

powiększenie mikroskopu = d*1/f1*f2

gdzie: d - odległość dobrego widzenia (250 mm), 1 - odległość obrazu od soczewki, w przybliżeniu długość tubusu (160-170 mm). fi - odległość ogniskowa soczewki obiektywu, I2 - odległość ogniskowa soczewki okularu.

> Zdolność rozdzielcza Jest to najmniejsza odległość miedzy dwoma punktami leżącymi blisko siebie, przy której punkty te nie zlewają się w jeden obraz i widziane są jako oddzielne.

Zdolność rozdzielcza zależy wyłącznie od obiektywu i określa ją wzór: D=λ/2*A

gdzie: D - najmniejsza odległość między punktami, X - długość fali światła, A - apertura numeryczna.

Apertura numeryczna wyraża się wzorem A= n * sin α,

gdzie: n - współczynnik załamania światła pomiędzy preparatem a obiektywem a - kąt aperturowy (kąt utworzony przez skrajny promień wchodzący do soczewki czołowej obiektywu z osią optyczną obiektywu).

Kąt aperturowy I - dla obiektywu imersyjncgo. II - dla obiektywu suchego

Dla różnych obiektywów wartości apertury są różne. Obiektywy suche mają niższą aperturę, poniżej 1, a wartość apertury numerycznej w obiektywach imersyjnych jest wyższa i wynosi powyżej I. Zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego zwykłego wynosi 0,2 urn.

Technika mikroskopowania

> Ustawić mikroskop około 20 cm od brzegu stołu,

> włączyć oświetlenie mikroskopu,

> w oś optyczną mikroskopu włączyć obiektyw o najmniejszej sile powiększającej i ustalić jego odległość na około 3 cm od stolika,

> preparat umieścić na stoliku i umocować,

> patrząc w okular podnosić tubus (delikatnie oburącz kręcąc śrubą makrometryczną) aż do uzyskania obrazu preparatu,

> ostrość obrazu ustawić poprzez delikatne manipulacje śrubą mikrometryczną.

Jeśli mikroskopujemy przy użyciu obiektywów imersyjnych, lo najpierw należy znaleźć obraz obiektywem suchym i dopiero później w oś optyczną włączyć obiektyw imersyjny, a na preparat nanieść krople, olejku cedrowego. I postępować dalej w następujący sposób:

> patrząc z boku, opuścić tubus za pomocą śruby makrometrycznej aż do zanurzenia soczewki czołowej w olejku,

> manipulując wolno śrubą makrometryczną (soczewka czołowa musi być przez cały czas zanurzona w olejku) znaleźć obraz,

> śrubą mikrometryczną nastawić odpowiednią ostrość obrazu.

Podczas mikroskopowania bardzo istotne jest właściwe oświetlenie preparatu, dlatego należy pamiętać o skorygowaniu intensywności oświetlenia poprzez odpowiednie położenie aparatu oświetlającego. Przy mniejszych powiększeniach kondensor należy opuścić, przy największym podciągnąć go maksymalnie do góry.

Konserwacja mikroskopu Po zakończonej obserwacji należy:

> zetrzeć olejek z obiektywu imersyjnego, używając do tego celu miękkiej nawilżonej ksylenem ściereczki,

> wytrzeć specjalną miękką ściereczką pozostałe soczewki obiektywów i okularów,

> części mechaniczne wytrzeć z kurzu i ewentualnych zanieczyszczeń, r mikroskop przykryć osłoną z folii.

Inne typy mikroskopów

Mikroskop ciemnego pola Zastosowanie odpowiednich kondensorów wyposażonych w specjalną przesłonę powoduje, że światło nie przechodzi bezpośrednio do soczewki obiektywu. Obiektyw odbiera jedynie promienie, które napotykając preparat ulegają rozproszeniu, załamaniu lub ugięciu od dotychczasowego kierunku. W ten sposób w ciemnym tle widoczne są jasno świecące badane obiekty.

Mikroskop fluorescencyjny W przypadku tych mikroskopów wykorzystywane jest zjawisko fluorescencji. Zawiesinę bakterii, z której przygotowuje się preparat, należy nasycić związkami fluorescencyjnymi i wówczas w mikroskopie oświetlonym światłem ultrafioletowym widoczne są świecące komórki.

Mikroskop ultrafioletowy Źródłem światła w tego typu mikroskopie są promienie UV (są krótsze od promieni światła widzialnego), dzięki czemu w' porównaniu z mikroskopem optycznym zwykłym zostaje zwiększona zdolność rozdzielcza. Ponieważ szkło sodowe nie przepuszcza promieni UV, soczewki w tym mikroskopie wykonane są z kwarcu. Również szkiełka przedmiotowe, na których wykonuje się preparaty, w tym przypadku muszą być wykonane ze szkła kwarcowego. Obraz mikroskopowy przedstawiany jest na ekranie luminescencyjnym lub na błonie fotograficznej.

Mikroskop elektronowy W odróżnieniu od mikroskopu świetlnego, zamiast promieni świetlnych, w tym wypadku stosuje się wiązki strumienia elektronów. Emitowane elektrony skupiane są w polu magnetycznym lub elektrostatycznym. Zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego wynosi około 5 A i jest kilkaset razy większa w porównaniu z najlepszymi mikroskopami świetlnymi (2000A). Mikroskopy elektronowe dzielą się na prześwietleniowe, cieniowe i do bezpośredniego oglądania obiektów. Najbardziej rozpowszechnionymi, ze względu na dużą zdolność rozdzielczą, są mikroskopy elektronowe prześwietleni we. Powiększony obraz badanego obiektu obserwuje się na ekranie fotorysującym, utrwala fotograficznie lub za pomocą kamery. Preparaty oglądane w mikroskopie elektronowym wymagają szczególnego przygotowania. Przy użyciu specjalnego urządzenia tzw. ultramikrotomu komórki są cięte na ultra skrawki i następnie pokrywane metalem.