02
Uwagi:
1) Fenol jest substancją silnie żrącą i mutagenną, więc należy stosować środki ostrożności w postaci rękawic i okularów ochronnych. Miejsca kontaktu skóry z fenolem powinno się spłukiwać dużą ilością wody i zmywać mydłem. Nie należy w tym celu używać etanolu.
2) Wydajność procedury wynosi około 20 pg DNA na 500 pl krwi.
3) Stosunek A260//4280, który jest miarą czystości DNA, powinien wynosić 1,7-2,2.
4) Otrzymany DNA nadaje się do trawienia enzymami restrykcyjnymi oraz do zastosowania jako matryca w reakcji PCR (polymerase chain reaction — reakcja łańcuchowa polimerazy).
Ćwiczenie 10.3. Izolowanie DNA metodą odsalania białek (D.T. Bilton, M. Jaarola 1995 w: Methods in molecular biology. red. J.P. Clapp, Humana Press Inc., Totowa, s. 25-37)
Zasada: Odbiałczanie DNA w tej metodzie zachodzi w wyniku odsalania białek komórkowych poprzez odwodnienie i wytrącanie z użyciem nasyconego roztworu NaCl. Technika ta jest stosunkowo prosta i tania. Ekstrakcja przeprowadzana bez użycia fenolu zmniejsza ryzyko, co ma znaczenie szczególnie w pracy z wieloma próbkami.
Materiał: Tkanka zwierzęca świeża lub zamrożona.
Odczynniki:
1) Bufor ekstrakcyjny: 3M NaCl - 0,4 M Tris/HCl (pH 7,8) - 20 mM EDTA.
2) 25% roztwór SDS.
3) Roztwór proteinazy K o stężeniu 10 mg/ml.
4) 6 M roztwór NaCl.
5) Chloroform.
6) Absolutny etanol.
7) 70% roztwór etanolu.
8) 10 mM bufor Tris/HCl (pH 8,0).
9) Bufor TE o pH 8,0: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA.
Ważniejsze przyrządy: Homogenizator nożowy (jeśli stosuje się jako materiał tkankę stałą), mikro-wirówka.
Wykonanie:
1. Preparatykę tkanki należy przeprowadzić tak jak w ćw. 10.1.
2. W probówce o pojemności 1,5 ml umieścić rozdrobnione 25-50 mg tkanki stałej lub zawiesinę interfazową z 1-1,5 ml krwi i dodać 400 pl buforu ekstrakcyjnego (odcz. 1), 20 pl proteinazy K (odcz. 3) oraz 10 pl roztworu SDS (odcz. 2) i łagodnie mieszać przez powolne obracanie probówki.
3. Inkubować w temp. 55°C przez co najmniej 3 godz. (najlepiej 12 godz.). Dodać 250 pl nasyconego roztworu NaCl (odcz. 4) i wytrząsać ręcznie. Wprowadzić 650 pl chloroformu i łagodnie mieszać przez powolne obracanie probówki do utworzenia emulsji.
4. Odwirować (13 000 x g w temp. pokojowej przez 30 min). Przenieść górną fazę wodną do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 pl buforu Tris (odcz. 8) i 750 pl etanolu (odcz. 6) ochłodzonego do temp. 0°C. Inkubować w lodzie przez 30 min dla wytrącenia DNA.
372
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
CHLOREK ZELAZA III Chlorek żelaza (III) jest substancją silnie żrącą i należy z nim pracować jedynie
PrepOrg II064 (2) 66 Uwagi; 1. Chlorek glinowy jest zwięzkiem silnie hlgroakopijny
40556 Skanuj9 Układ mięśniowy mięśni podaje się pochodne kurary - sama kurara jest zbyt silnie dział
ZJ CW01 by p4aveu 252525252804 2525252529 WBUWADZEMF UWAGI 1 Cykl jest działaniem
65 Napór ze strony niemieckiej jest coraz silniejszy; miejsca opróżnione przez księży Polaków zajmuj
Img00255 259 sosnowego lub świerkowego. Jako materiał włóknisty jest on silnie higroskopijny. Aby pa
sr2 jeśli koło jest wielkie, to w środku znajdzie się wysepka zielonej trawki. Koło grzybowe okala
PrepOrg II112 (2) - 115 - 87, ETER ETYLOV/0~2-NAFTYLO)7V 17 kolbie kulistej o pojemności 100 cm^ ro
skan0 ,10 Meajrfueje o pierwsi) jest on tym samym woskiem, co ten, który widzę, którego dotykam, kt
T540 Na rysunku pokazany jest czołg średni T-54 nowszej odmiany (T-54A), wyprodukowany przez polski
IMG70 BN *0«*13000 Tam gdzie niezbędne jest zapewnienie wiarygodnych wyników, wyposażenie pomiarowe
page0069 59 formacyj s ubstancyj n y ch nazywa Arystoteles materyą pierwszą Ta materya nie jest sub
więcej podobnych podstron