GENETYKA Anna Sadakierska Chudy , Grażyna Dąbrowska str7

56 Rozdział 5

Zdolności transformujące posiada:

dwuniciowy, natywny DNA o długości ok. 8-10 kpz,

- plazmidowy DNA.

Najwyższą częstość transformacji genomowym DNA uzyskuje się w obrębie gatunku, nie można uzyskać między rodzajowej transformacji chromosomowego DNA. Transformacja między gatunkowa zachodzi rzadko i przede wszystkim pomiędzy pokrewnymi gatunkami. Transformanty międzygatunkowe najczęściej nie powstają, ponieważ homologia odcinków DNA jest zbyt mała. Transformacja nie-homologicznym DNA jest możliwa, o ile transformujące DNA jest zintegrowane w wektorze prokariotycznym (plazmidowym lub fagowym). Wektory to cząsteczki DNA mające zdolność samoreplikacji w^r komórce gospodarza, co umożliwia namnażanie włączonych do nich fragmentów' DNA.

Wydajność transformacji zależy od:

a) stopnia pokrewieństwa (maleje wraz z malejącym stopniem pokrewieństwa),

b) liczby kompetentnych komórek biorcy,

c) stężenia DNA (zależność ta jest liniowa, ale zw iększenie stężenia powyżej dawki nasycenia nie powoduje wzrostu liczby transformantów).

d) odpow iedniej temperatury.

5.2.1. Plazmidy

Plazmidy to pozachromosomowe, stabilne cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące niew ielką liczbę genów nieistotnych dla podstawowego metabolizmu komórki. Najczęściej są to dwuniciowe, koliste DNA występujące w komórkach bakteryjnych, wielkość ich waha się w granicach od 1 kpz do ponad 250 kpz. Plazmidy stanow ią niewielką część genomu komórki bakteryjnej, mniej niż 1% genów może znajdow ać się w plazmidach. Większość znanych plazmidów występuje w komórkach jako superzwinięte koliste cząsteczki dsDNA (ang. double strandedDNA), wyjątek stanow i plazmid killer, występujący u drożdży w postaci dwuniciowej cząsteczki RNA oraz plazmidy liniowe u bakterii Borrelia burg-dorferi czy Streptomyces lividans.

Podstawowe cechy plazmidów:

1. Posiadają sekwencje ori (ang. origin) odpow iedzialne za inicjację replikacji.

2. Replikują zależnie lub niezależnie od chromosomowego DNA. Do replikacji wykorzystują enzymy komórkowe (kodowane przez DNA chromosomowe), większe plazmidy kodują własne enzymy.

3. Zawierają geny, które nie występują na chromosomie bakteryjnym (np. geny oporności na antybiotyki).

4. Niektóre integrują do genomu i w tak zintegrowanej formie zw anej episo-mem przechodzą podziały komórkowe, po czym ponownie oddzielają się od chromosomu.

5. W komórce może występować kilka rodzajów plazmidów, o ile wykazują zgodność (liczba plazmidów jest różna u różnych gatunków bakterii).

Znane są różne rodzaje plazmidów:

a) plazmidy typu R - niosą geny oporności na antybiotyki, np. ampicylinę, chloramfenikol,

b) plazmidy typu F przenoszą geny w procesie koniugacji, warunkują wytworzenie fimbrii, w formie F' mogą przenosić geny dodatkowe przejęte z chromosomu,

c) plazmidy kolicynowe - kodują białka zwane kolicynami. zabijające inne bakterie,

d) plazmidy degradacyjne kodują białka umożliwiające rozkład nietypowych związków (np. toluenu, kwasu salicylowego),

e) plazmidy wirulencji - nadają bakteriom zdolność do wywoływania chorób (np. plazmid Ti z Agrobacteńum tumefaciens, powodujący chorobę roślin zwaną guzowatością korzeni).

Plazmidy wykryte w latach 70. ubiegłego wieku dzięki swoim zaletom bardzo s/ybko przyczyniły się do rozwoju inżynierii genetycznej. Początkowo jako wektory wykorzystywane były naturalnie występujące plazmidy, np. ColEJ. Wszystkie obecnie stosowane wektory plazmidowe złożono z fragmentów DNA pochodzących z różnych źródeł.

5.2.2. Mechanizm transformacji

Mechanizm transformacji nie jest jeszcze dokładnie poznany, wiadomo, źc różni się on pomiędzy bakteriami Gram-dodatnimi i Gram-ujemnymi. Transformacja jest zjawiskiem naturalnym dla wielu gatunków bakterii. Istnieją również gatunki bakterii, np. E. coli, które nic ulegają naturalnej transformacji, ale można je sztucznie indukować do pobrania DNA.

Etapy transformacji:

1. Wejście komórki w stan kompetencji.

2. Absorpcja DNA na powierzchni komórki.

3. Pobranie DNA do wnętrza komórki.

4. Wbudowanie egzogennego genomowego DNA do własnego genomu poprzez rekombinację lub doreplikowanie drugiej nici DNA w^r przypadku transformacji plazmidowym DNA.

Transformacja naturalna

Transformacja naturalna występuje u wiciu gatunków bakterii: Bacillus suhti-lis. Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae. Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Rhizobium. Proces ten jest możliwy tylko na pewnych etapach ich cyklu życiowego i zachodzi w określonych warunkach.

Stan, w którym bakterie mogą być transformowane nazywamy stanem kompetencji. Przypuszcza się, że stan ten związany jest z protoplastyzacją ściany ko-