31737 skanuj0016

produkt (pmole) ~ czas (min)

Ryc. 1. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w czasie

Odczynniki:

- jak przy wyznaczaniu optimum pH Wykonanie:

Do wyznaczenia szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę przygotowujemy 3-4 różne rozcieńczenia ekstraktu z ziemniaka (różne stężenie enzymu). Każda para przygotowuje jedno z wybranych rozcieńczeń ekstraktu, np. 10x, 50x, 100x lub 250x (ekstrakt należy rozcieńczyć 0,9% roztworem NaCl w kolbie miarowej) i wykonuje oznaczenie szybkości początkowej, dodając do mieszaniny reakcyjnej wyciąg o określonym rozcieńczeniu.

Do suchych probówek (próby wykonać w dwóch powtórzeniach') pipetujemy po 0,25 ml buforu octanowego o pH optymalnym dla aktywności fosfatazy kwaśnej i 0,25 ml roztworu substratu. Tak więc każda próba zawiera 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej o pH optymalnym dla fosfatazy kwaśnej. Próby umieszczamy w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Reakcję enzymatyczną rozpoczynamy dodając do każdej próby w odstępach co 30 sekund po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x, 100x lub 250x). Próby inkubujemy: 2, 4, 6, 8, 10 i 12 minut. Reakcję przerywamy dodając do probówek 5 ml 0,1M roztworu NaOH w odstępach 30-sekundowych (w tej samej kolejności jak dodawano enzym). Próby zerowe przygotowujemy pipetując do probówki 0,25 ml buforu o optymalnym pH oraz 0,25 ml p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubujemy 12 minut w termostacie razem z próbami badanymi, po czym dodajemy 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec 0,5 ml enzymu o odpowiednim stężeniu. Dokonać pomiaru absorbancji przy długości fali X = 405 nm wobec próby zerowej.

Opracowanie wyników:

Na podstawie otrzymanych wyników dla każdego stężenia enzymu należy wykreślić zależność szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyrażonej jako absorbancja przy 405 nm) od czasu inkubacji - poszczególne pary wymieniają się wynikami. Przedyskutować uzyskane wyniki! Dlacaego próby zerowe inkubujemy w łaźni wodnej bez enzymu?

7

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
skanuj0002 13. z wyjątkiem Lipaz min. aw konieczne do przebiegu reakcji enzymatycznej to:aw> 0,85
182 W. MAKAREWICZ [14) Czas (min.) Ryc. 4. Produkcja amoniaku i zmiany stężeń nukleotydów
Obraz4 Czas inkubacji (t) Wyznaczanie szybkości początkowej (Vo) reakcji enzymatycznej: a ( pmole)
skanuj0026 (93) 279 279 gdzie: a i a - są odpowiednio ilością odcinków podstawy czasu T [s] w czasi
415 [1024x768] 424 ELEKTROCHEMIA Produkty reakcji są takie same jak poprzednio, jednakże grupy, któr
skanuj0003 (82) 3r.ż. — 200 min. ( do tego okresu maksymalny wzrost) tr7 — 2X0 min,: dorosły 30
198 Czas w min lat od chwili obecnej Ryc. 5.9.1 lipotetyczny model ewolucji stosunków izotopowych st
larsen0020 20 I Podstawy farmakologiczne i fizjologiczne czas do spadku do 50% [min] czas trwania in
DSCF4865 zagęszczenie czas zagęszczenie Ryc. 18. Dwa podstawowe typy krzywych wzrostu populacji: w k
26157 skanuj0424 produktu wyodrębnia fazy ze względu na tempo wzrostu popytu (por. punkt 2.6). W pie
8 (131) m czas [min] Rysunek 2. Ilość zużytego ciepła w trakcie procesu ogrzewania produktu w funkcj

więcej podobnych podstron