KWASY NUKLEINOWE
Iwona śak
19.
Kwasy nukleinowe, deoksyrybonukleinowy (DNA) i rybonukleinowy (RNA),
są chemicznymi nośnikami informacji genetycznej w komórkach. Informację gene-
tyczną stanowi chemicznie zapisana (alfabetem zasad azotowych) kolejność
deoksyrybonukleotydów w łańcuchach DNA, która przechowywana jest głównie
w jądrze komórkowym. Informacja genetyczna jest przepisywana (transkrypcja),
po czym przekazywana do cytoplazmy w formie sekwencji polirybonukleotydo-
wej łańcuchów RNA. Przepisana informacja genetyczna na jeden z kwasów ry-
bonukleinowych (mRNA) słu\y do odczytania, przetłumaczenia na nowy język
(o alfabecie aminokwasowym), tym samym stanowi bezpośrednią matrycę, na
której materializuje się informacja genetyczna w formie specyficznej sekwencji
aminokwasowej polipeptydów (translacja).
W jądrowym DNA zakodowany został unikatowy program genetyczny ka\-
dej komórki, kierujący biosyntezą enzymów i wszystkich innych białek potrzeb-
nych do funkcjonowania komórek oraz kontrolujących wzrost, rozmna\anie, tym
samym naturÄ™ ka\dego \ywego organizmu.
Kwasy nukleinowe są nierozgałęzionymi łańcuchami polinukleotydowymi,
w których kolejne mononukleotydy połączone są wiązaniami 3 5 fosfodiestrowymi,
tworzącymi obwodowy, ujemnie naładowany rdzeń fosfocukrowy, od którego ster-
czÄ… na bok zasady azotowe. Ze specyfiki wiÄ…zania fosfodiestrowego wynika, \e
ka\dy łańcuch polinukleotydowy jest polarny, czyli ma dwa ró\ne końce, koniec-5'
i koniec-3'. Koniec-5' polinukleotydu oznacza, \e przy piątym atomie węgla (C5')
rybozy lub deoksyrybozy znajduje siÄ™ fosforan (lub atom tlenu, gdy jest to tylko
fragment całości). Z punktu widzenia powstawania polinukleotydu, koniec-5' jest
rzeczywistym jego poczÄ…tkiem. Koniec-3' polinukleotydu oznacza, \e przy trze-
cim atomie węgla (C3') rybozy lub deoksyrybozy znajduje się wolna grupa hydrok-
sylowa (lub atom tlenu, gdy jest to tylko fragment całości). Koniec-3' jest rzeczy-
wistym końcem polinukleotydu. Przyjęto, \e sekwencję nukleotydów, czyli struk-
turę pierwszorzędową polinukleotydów, zapisuje się, poczynając od końca-5' z le-
wej strony, za pomocą skrótów jednoliterowych nazw nukleozydów.
325
NH2
N
C
O N
'
5
O CH2 O
O
5 H H
CH3
H H
'
3 HN
H
T
O
O N
O- P O
'
5
O
CH2 O
NH2
H H
H H
N
'
3
N
H
A
O
N
N
O- P O
'
5
O CH2 O
O
H H
H H
'
N
3
NH
H
G
O
N
N NH2
O- P O
'
5
O
CH2 O
H H
H H
'
3
H
O
3
Polinukleotyd polarny o kierunku 5 3 , z rdzeniem utworzonym z powtarzajÄ…cych siÄ™
reszt fosfodeoksyrybozy, od którego sterczą na bok zasady azotowe
326
Kwas deoksyrybonukleinowy
Polimer deoksyrybonukleotydów stanowi informację genetyczną we wszyst-
kich organizmach \ywych, z wyjątkiem niektórych wirusów typu RNA. Eukario-
tyczny DNA występuje w postaci łańcuchowego dwuniciowego polimeru, nato-
miast prokariotyczny DNA to z reguły struktura zamknięta, kolista. Cząsteczka
DNA jedynie u bakteriofaga (Ć174) jest jednoniciowa, lecz w cyklu \yciowym te-
go faga pojawia siÄ™ struktura dwuniciowa DNA.
CzÄ…steczki DNA sÄ… olbrzymie, ich masy czÄ…steczkowe mogÄ… siÄ™gać 1,9 Å" 106
daltonów, wielkość 2,6 Å" 106 kilozasad (kb), a dÅ‚ugość do 12 cm.
Obie nici DNA biegną w przeciwnych kierunkach, czyli są antyrównoległe
w odniesieniu do ich 5'3' kierunków i mają komplementarną sekwencję. Kom-
plementarność przeciwległych nici wynika ze struktury zasad azotowych i prze-
strzennych ograniczeń rdzenia fosfocukrowego DNA. Komplementarne pary piry-
midyna puryna o podobnej geometrii i wymiarach sÄ… utrzymywane wiÄ…zaniami
wodorowymi. Tymina tworzy parÄ™ z adeninÄ…, stabilizowanÄ… dwoma wiÄ…zaniami
wodorowymi.
H
O H N
H3C N
N H N N
cukier
N N
O
cukier
T A
Cytozyna łączy się z guaniną za pośrednictwem trzech wiązań wodorowych.
H
N H O
N
N H N N
cukier
N N
cukier
O H N
H
C G
W obrębie dwuniciowego DNA wyró\nia się tzw. pasmo matrycowe, ina-
czej zwane nonsensownym lub wiodącym, które zaczyna się końcem 3', zawiera
informacjÄ™ genetycznÄ… i jest matrycÄ… do transkrypcji czÄ…steczek RNA. Drugie,
przeciwległe do matrycowego to tzw. pasmo kodujące, inaczej zwane, sensow-
327
nym lub opózniającym, które zaczyna się końcem 5'. Sekwencja tego pasma odpo-
wiada transkryptowi (początkowy produkt transkrypcji), który koduje białko (poza
faktem, \e zamiast T jest U) i stÄ…d wywodzi siÄ™ jego nazwa.
W latach 1949 1953 Erwin Chargaff wraz z współpracownikami przepro-
wadzili szczegółowe badania z zastosowaniem metod chromatograficznych nad
zale\nościami ilościowo-jakościowymi między zasadami azotowymi w hydroliza-
tach DNA, pochodzących z ró\nych zródeł. Wyniki tych analiz chemicznych (zna-
ne jako reguły Chargaffa) nie były zrozumiałe a\ do czasu zaproponowania i zdefi-
niowania modelu dedukcyjnego dwuniciowej, helikalnej struktury drugorzędowej
DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka w 1953 roku. Zaproponowany prze-
strzenny model Watsona-Cricka wyjaśnił, \e reguły Chargaffa odzwierciedlają
podstawowe cechy struktury DNA.
Podstawowymi regułami Chargaffa są następujące prawidłowości:
Ò! zawartość molowa A równa siÄ™ T,
Ò! zawartość molowa G równa siÄ™ C,
Ò! suma stÄ™\eÅ„ A+G równa siÄ™ sumie stÄ™\eÅ„ C+T.
Z reguł tych wynika, \e wystarczy znać udział procentowy tylko jednego z
czterech nukleotydów (np. A), aby ustalić udział procentowy wszystkich pozosta-
łych trzech nukleotydów (T, C, G) w analizowanej cząsteczce DNA.
Natomiast stosunek sumy stę\eń molowych A+T do sumy stę\eń G+C jest
gatunkowo specyficzny, w zwiÄ…zku z tym wszystkie czÄ…steczki DNA mo\na skla-
syfikować w trzy typy, mianowicie:
Ò! czÄ…steczki DNA, w których [A] + [T] > [G] + [C],
Ò! czÄ…steczki DNA, w których [A] + [T] < [G] + [C],
Ò! czÄ…steczki DNA, w których [A] + [T] = [G] + [C].
Cząsteczki DNA pierwszego typu są najbardziej powszechne, z reguły ró\-
nice między sumą AT a sumą GC okazują się stosunkowo niewielkie, przedstawi-
cielami ich mogą być zarówno cząsteczki DNA pochodzące z wirusów (Polyoma),
bakterii (Mycoplasma), dro\d\y, muszek (Drosophila), jak i z organizmu człowie-
ka. Przedstawicielem DNA trzeciego typu mogą być cząsteczki DNA wywodzące się
z Echerichia coli. Rzadko występują cząsteczki DNA drugiego typu, obecne np.
u Alcaligenes faecalis.
Kwasy deoksyrybonukleinowe lub ich rejony mogą występować w trzech
głównych formach przestrzennych (strukturach drugorzędowych) zwanych A, B
i Z. Dominującą strukturą drugorzędową DNA jest forma B, będąca regularną pra-
woskrętną helisą, zgodną z modelem Watsona i Cricka. Oba antyrównoległe łańcu-
chy B-DNA zwijają się helikalnie wokół osi helisy, do której pary zasad azo-
towych układają się prostopadle.
328
B-DNA
Z-DNA
A-DNA
Schematyczne diagramy głównych form: A-, B-, Z-DNA. (wg [12], zmodyfikowane)
W centrum helisy DNA znajdują się zasady azotowe obu nici, których płasz-
czyzny uło\one są jedna nad drugą w formie charakterystycznych dwóch stosów,
stabilizowanych warstwowo oddziaływaniami hydrofobowymi. Na zewnątrz helisy
DNA umiejscowione są oba rdzenie fosfocukrowe, pomiędzy którymi przebiegają
helikalnie dwie bruzdy (rowki): mała o szerokości 6 Ši du\a o szerokości 12 Š.
rdzeń cukrowo-
-fosforanowy
329
Obecność bruzd sprawia, \e mo\e mieć miejsce specyficzne rozpoznawanie,
oddziaływanie lub wiązanie białek regulatorowych, np. kontrolujących ekspresję
genów (poprzez ich moduły oddziaływujące bezpośrednio z DNA np. tzw. palce
cynkowe lub typu helisa-zwrot-helisa, lub suwaka leucynowego) z określonymi
(swoistymi) sekwencjami zasad azotowych, ukrytymi w centrum helisy, bez roz-
rywania dwupasmowej struktury DNA.
Przez bruzdy te mogą równie\ wsuwać się ró\ne płaskie aromatyczne czą-
steczki policykliczne, które wślizgują się między pary zasad azotowych uło\one
w stosy, czyli ulegają procesowi interkalacji. Zgodnie z tym mechanizmem działa
wiele związków rakotwórczych, a tak\e leków przeciwnowotworowych.
W formie B helisy DNA występują reszty deoksyrybozy C2'-endo, wiązania
glikozydowe o konformacji anty, 10 par zasad azotowych przypada na ka\dy pełny
skrÄ™t, który ma wysokość 34 Å, a Å›rednica helisy wynosi 23,7 Å. W formie A pra-
woskrętnej helisy DNA występują reszty deoksyrybozy C3'-endo, wiązania gliko-
zydowe o konformacji anty, 11 par zasad azotowych przypada na ka\dy pełny
skrÄ™t, który ma wysokość 25 Å, Å›rednica helisy zaÅ› wynosi 25,5 Å. W formie A
pary zasad azotowych nachylone sÄ… do osi helisy pod kÄ…tem 20°, zatem nie sÄ… do
niej prostopadłe, jak w formie B. Występuje praktycznie tylko jedna głęboka bruz-
da du\a. W sekwencji formy Z helisy DNA występują przemiennie nukleotydy
purynowe i pirymidynowe np. GC, AC. W tej formie DNA wszystkie nukleotydy
purynowe majÄ… wiÄ…zania glikozydowe konformacji syn, natomiast nukleotydy pi-
rymidynowe zawierają wiązania glikozydowe konformacji anty. Obrót tych par
zasad o 180° wokół wiÄ…zania N-glikozydowego powoduje, \e Z-DNA jest helisÄ…
lewoskrętną. Sprawia to równie\, \e obwodowe rdzenie fosfocukrowe tworzą wzór
zygzakowaty i stÄ…d wywodzi siÄ™ nazwa tej formy Z-DNA. W formie Z-DNA pary
zasad azotowych odchylone sÄ… od osi helisy o kÄ…t 10°, zatem nie sÄ… do niej prosto-
padłe, jak w formie B. Forma Z jest najbardziej wydłu\ona spośród wszystkich
trzech form DNA, na ka\dy pełny skręt przypada 12 par zasad azotowych, skok
helisy wynosi 45,6 Å, a Å›rednica 18,4 Å. Forma ta ma tylko maÅ‚Ä… gÅ‚Ä™bokÄ… bruzdÄ™,
która jest wąska. Z-DNA wymaga wysokiego stę\enia soli lub specyficznych ka-
tionów, poliamin (spermina, spermidyna) do stabilizacji i nie tworzy struktur nu-
kleosomowych.
Występowanie w obrębie DNA fragmentów o zró\nicowanej strukturze
sprawia, \e długie łańcuchy polideoksyrybonukeinowe nie są sztywnymi helikal-
nymi zwojami cylindrycznymi, lecz tworzą liczne zagięcia, struktury, tzw. spinki
do włosów lub superhelikalne skręty. Ró\norodność strukturalna fragmentów DNA
zwiększa jego zdolność do rozpoznawania i oddziaływania z innymi składnikami
komórki.
Większość sekwencji DNA eukariotycznego stanowi kompleks nukleopro-
teinowy, głównie w formie nukleosomów.
330
Rdzeń nukleosomu stanowi oktamer zło\ony z ośmiu histonów, mianowicie
H2A, H2B, H3 i H4, z których ka\dego jest po dwa. Oktamer owinięty jest lewo-
skrętnie przez łańcuch 146 par zasad azotowych, stanowiący 1,75 skrętu helisy
DNA. Poszczególne nukleosomy połączone są fragmentem DNA, zwanym łączni-
kiem, zawierajÄ…cym od 40 do 80 par zasad. Histon H1 znajduje siÄ™ poza oktame-
rem, mo\e zewnętrznie ochraniać krótkie fragmenty DNA nukleosomu w miej-
scach, od których zaczynają się łączniki. Histony neutralizują wzajemne odpycha-
nia ujemnych ładunków obecnych na rdzeniach cukrowo-fosforanowych. Ponadto,
umo\liwiają ciasne upakowywanie nici DNA do ró\nych form skondensowanej
heterochromatyny, a\ do chromosomu, który jest maksymalnie skondensowaną
formą DNA. Rozwinięcie tych struktur ma miejsce wówczas, gdy DNA uczestni-
czy w replikacji lub transkrypcji. Właściwa organizacja nukleosomów i innych
kompleksów białkowych z DNA wymaga działania równie\ białek opiekuń-
czych , tzw. chaperonów (fonetycznie: czaperonów).
Kwasy rybonukleinowe
Cząsteczki kwasów rybonukleinowych są znacznie mniejsze od cząsteczek
DNA, ich masa cząsteczkowa osiąga 35 000 daltonów. Wszystkie cząsteczki RNA
są formami jednoniciowymi, niektóre mogą tworzyć rejony dwuniciowe, stabili-
zowane wiązaniami wodorowymi między komplementarnymi zasadami azotowy-
mi. Rejony dwuniciowe w obrębie pojedynczej nici polinukleotydowej powstają
między sekwencjami komplementarnymi, które są rozmieszczone w ró\nych rejo-
nach liniowej struktury pierwszorzędowej, oddziałują ze sobą parami i są stabili-
zowane wiązaniami wodorowymi. Oddziaływania te sprawiają, \e pojawiają się
sparowane rejony dwuniciowe w obrębie pojedynczej nici polinukleotydowej.
Rejony sparowane nadają określoną strukturę przestrzenną cząsteczce.
RNA zamiast deoksyrybozy zawiera rybozÄ™, a zamiast tyminy uracyl. Wy-
ró\nia się trzy główne typy RNA, z których ka\dy spełnia odmienne funkcje, są to:
informacyjny RNA (mRNA), transportujÄ…cy RNA (tRNA) i rybosomalny RNA
(rRNA).
Wszystkie wymienione typy kwasów rybonukleinowych eukariotycznych są
produktami ró\norodnych modyfikacji chemicznych, które mają miejsce po tran-
skrypcji i składają się na proces określany mianem dojrzewania RNA, któremu
podlega większość pierwotnych transkryptów (bezpośrednich produktów tran-
skrypcji). Proces dojrzewania RNA obejmuje następujące zmiany: 1) usuwanie
pewnych sekwencji nukleotydowych przez endonukleazy, rybozymy i egzonukle-
azy; 2) dodawanie nukleotydów do końca 5' i 3' pierwotnego transkryptu lub pro-
duktu jego rozcięcia; 3) chemiczne modyfikacje (głównie metylacje) niektórych
nukleotydów w obrębie zasad azotowych lub reszt monocukrowych. Kwasy rybo-
331
nukleinowe oddziałują z białkami, tworząc kompleksy rybonukleoproteinowe
(RNP).
mRNA
Informacyjny RNA słu\y jako matryca w syntezie białka. W komórce jest
tyle specyficznych rodzajów cząsteczek mRNA, ile komórka syntetyzuje rodzajów
łańcuchów polipeptydowych. Informacyjne RNA stanowią około 5% wszystkich
kwasów rybonukleinowych w komórce. Dojrzałe cząsteczki mRNA mają po-
dobny plan budowy w komórkach eukariotycznych.
czapeczka sekwencja kodujÄ…ca ogon poli(A)
P~P-
AAAA.....AAAAAA
-N7CH3G N6CH3A N6CH3A
Schematyczny plan budowy eukariotycznego mRNA
W budowie większości eukariotycznych mRNA charakterystyczne jest wy-
stępowanie trzech stałych elementów, mianowicie czapeczki (ang. cap) znajdującej
się na końcu 5', specyficznej sekwencji kodującej i ogona poli(A) , który wystę-
puje na końcu 3'.
Czapeczkę stanowi reszta N7-metyloguanozyny o odwróconej orientacji
(w porównaniu z typowymi wiązaniami 3'5'-fosfodiestrowymi), która połączona
jest mostkiem 5'-5'-trifosforanowym, najczęściej z N6-metyloadenozyną. Ta szcze-
gólna chemiczna modyfikacja powstaje kotranskrypcyjnie, zanim syntetyzowany
RNA osiągnie długość 20 30 nukleotydów. Dwa pierwsze nukleotydy za czapecz-
ką mogą być metylowane, zarówno w pozycji atomu azotu zasady azotowej (zwy-
kle jest to N6 adeniny), jak i w pozycji C2' rybozy.
Funkcja czapeczki polega na ochronie pre-mRNA oraz mRNA przed działa-
niem 5'-egzonukleaz, ponadto uczestniczy w procesie dojrzewania mRNA (np.
w splicingu), w transporcie mRNA z jÄ…dra do cytoplazmy i translacji.
Sekwencja kodujÄ…ca (czyli rejon ulegajÄ…cy translacji) jest specyficzna dla
ka\dego rodzaju mRNA, tym samym odmienne rodzaje mRNA ró\nią się sekwen-
cjÄ… kodujÄ…cÄ…. Sekwencja kodujÄ…ca mRNA jest komplementarna do sekwencji ekso-
nów pojedynczej nici matrycowej DNA, przy czym U jest komplementarna do A
w nici DNA. Tym samym sekwencja kodująca mRNA stanowi kopię eksonów nici
kodującej DNA, jednak w mRNA występuje U wszędzie tam, gdzie w kodującej
nici DNA występuje T.
332
HO OH
C C
NH2
H H
HC CH
N
O
N
O- O O- 5'
5
'
N
H2 N N H2C O P O P O P O CH2 N N
O O- O
HN
N
O
O CH3 HC CH
H H
'
'
2
3
O
C C
OCH3
NH
CH2
N
O
O
O
P
O
O-
O
HC CH
H H
'
3
C C
OH
Struktura chemiczna czapeczki mRNA i przyległych nukleotydów
W procesie dojrzewania sekwencja kodująca jest składana z eksonów pre-
mRNA, po wycięciu sekwencji interweniujących, zwanych intronami (niekodu-
jących), które przerywają sekwencje kodujące zwane eksonami. Proces rozcinania
pre-mRNA, wycinania intronów i składania eksonów nazywa się składaniem
mRNA (ang. splicing). Reakcje te zachodzą w jądrze komórkowym i wymagają
obecności w intronie sekwencji na końcu 5'-GU-3', a na końcu 3' sekwencji
5'-AG-3', poprzedzonej sekwencjÄ… bogatÄ… w pochodne pirymidyny, zwanÄ… traktem
polipirymidynowym, przed którą ma znajdować się sekwencja rozgałęzienia.
Podczas składania mRNA, w wyniku ataku grupy 2'-hydroksylowej z reszty
nukleotydu adeninowego sekwencji rozgałęzienia na wiązanie z udziałem G z 5'
końca, powstaje charakterystyczna cząsteczka o kształcie lassa oraz wolny ekson 1.
Po czym następuje rozcięcie po reszcie G w sekwencji AG na końcu 3' intro-
nu, w wyniku czego intron zostaje uwolniony w postaci lassa i zdegradowany,
a dwie sekwencje eksonowe Å‚Ä…czÄ… siÄ™ ze sobÄ…. Podczas dojrzewania alternatywne-
go mo\e mieć miejsce przekształcanie pre-mRNA w więcej ni\ jeden rodzaj doj-
rzałego mRNA, dzięki ró\nym sposobom składania (tzw. alternatywne składanie).
Alternatywne składanie mRNA wynika ze zró\nicowanego u\ycia miejsc spli-
cingowych 5' i 3', dzięki wykorzystaniu ró\nych promotorów, u\yciu ró\nych
miejsc poli(A) i ostatecznie z pozostawienia jednych, a usunięcia innych eksonów.
333
W wyniku alternatywnego składania z jednego pre-mRNA powstają odmienne
sekwencje kodujące w mRNA dzięki ró\nym kombinacjom połączeń eksonów. Za
alternatywne składanie mRNA odpowiedzialne są czynniki swoiste dla określo-
nych typów komórek. Proces ten katalizowany jest przez kompleksy białek z ma-
Å‚ymi jÄ…drowymi RNA (snRNP).
Niezwykłą formą dojrzewania mRNA jest redagowanie RNA, w wyniku
którego ulega zmianie sekwencja pierwotnego transkryptu. Przykładowo, podczas
redagowania pre-mRNA apolipoproteiny-B w komórkach jelita u człowieka nastę-
puje pojedyncza zmiana zasady C na U, czego konsekwencjÄ… jest powstanie kodo-
nu stop w mRNA i skrócenie sekwencji kodującej do 6666 nukleotydów z długości
14 500 nukleotydów, której produktem jest apolipoproteina B48 o wielkości 241
kDa. W komórkach wątroby pre-mRNA apolipoproteiny-B nie ulega redagowaniu,
dlatego produktem sekwencji kodujÄ…cej tego mRNA jest apolipoproteina B100
o wielkości 512 kDa.
Ogon poli(A) to sekwencja 200 250 nukleotydów adeninowych, znajdująca
się na końcu 3' mRNA. Ogon poli(A) tworzy się posttranskrypcyjnie (w procesie
dojrzewania mRNA), w wyniku cięcia pre-mRNA, a następnie dodania łańcucha
reszt nukleotydów adeninowych, dzięki obecności specyficznej sekwencji w DNA
(tym samym w odpowiednim transkrypcie pre-mRNA), zwanej sygnałem poliade-
nylacji. Niektóre mRNA mają więcej ni\ jedno miejsce poliadenylacji, tzw. alter-
natywne miejsca poli(A), dzięki temu ró\ne miejsca mogą być u\yte w odmien-
nych warunkach, np. w ró\nych typach komórek, dając ostatecznie ró\ne dojrzałe
mRNA.
Ogon poli(A) stabilizuje mRNA, umo\liwia przyłączenie białek zabezpie-
czających ten kwas rybonukleinowy przed działaniem 3'-egzonukleaz. Ogon po-
li(A) mo\e pomagać w translacji mRNA.
tRNA
Cząsteczki tRNA pełnią funkcje cząsteczek adaptorowych, które dostarczają
aminokwasy do rybosomów, gdzie tworzone są wiązania peptydowe między ami-
nokwasami w kolejności określonej przez mRNA.
Transportujące RNA stanowią około 15% wszystkich kwasów rybonukle-
inowych w komórce. Istnieje przynajmniej jeden tRNA dla ka\dego z dwudziestu
aminokwasów (łącznie 61 tRNA).
Cząsteczki tRNA są małe, jak na kwasy nukleinowe, ich liniowa sekwencja
mo\e mieć długość od 60 do 95 nukleotydów, zazwyczaj 76. Na końcu 5' cząstecz-
ki znajduje się monofosforan, zwykle przy guanozynie, a na końcu 3' stała trójnu-
kleotydowa sekwencja 5'-CCA-3'. W sekwencji tej do grupy -OH przy C2' lub C3'
rybozy nukleotydu adeninowego przyłącza się aminokwas wiązaniem estrowym.
Sekwencja 5'-CCA-3 prokariotycznych tRNA jest zakodowana w genie, natomiast
334
u eukariota dodawana jest enzymatycznie podczas posttranskrypcyjnego procesu
dojrzewania pre-tRNA.
W strukturze pierwszorzędowej tRNA stwierdza się wiele zmodyfikowanych
nukleozydów, które mogą stanowić nawet 20% wszystkich nukleotydów w czą-
steczce. Zmodyfikowanymi nukleozydami, powszechnie występującymi w tRNA,
sÄ… pseudorydyna, rybotymina, dihydrourydyna, inozyna, N6-izopentenyloadenozy-
na, 4-tiourydyna, wszystkie wprowadzane sÄ… posttranskrypcyjnie w procesie doj-
rzewania. W cząsteczce tRNA znajduje się 15 niezmiennych nukleotydów.
Struktura pierwszorzędowa tRNA zawiera liczne, liniowo oddalone sekwen-
cje komplementarne, umo\liwiające powstawanie rejonów dwuniciowych, nadają-
cych określoną strukturę przestrzenną cząsteczce tRNA.
Struktura drugorzędowa typu liścia koniczyny jest charakterystyczna dla
wszystkich tRNA. W strukturze tej rejony komplementarne cząsteczki oddziałują
ze sobą, tworząc cztery ramiona i trzy pętle. Ramiona zawierają sparowane nukle-
otydy (połączone wiązaniami wodorowymi w komplementarne pary), natomiast
pętle tworzą niesparowane i w większości niezmienne nukleotydy.
Końce 5' i 3' polirybonukleotydu tRNA tworzą rejon (z 7 par nukleotydów)
sparowany wiązaniami wodorowymi, który nazywa się ramieniem akceptorowym
aminokwasu. Następne, bardzo krótkie ramię, które składa się z 3 lub 4 par kom-
3
A
C
C
5 p
G
PTLA PTLA
G
DHU
T¨C
G
C
T
¨
PTLA
ANTYKODONOWA
335
plementarnych nukleotydów sparowanych wiązaniami wodorowymi, poprzedza
pętlę dihydrourydylową (DHU). Jej nazwa wynika z obecności zmodyfikowanej
zasady dihydrouracylu. Pętla ta mo\e składać się z 7 10 nukleotydów. Po przeciw-
nej stronie ramienia akceptorowego znajduje się ramię antykodonowe, składające
się z 5 par komplementarnych nukleotydów sparowanych wiązaniami wodorowy-
mi, zakończone pętlą antykodonową. Pętla ta zawiera 7 nukleotydów, z których
trzy centralne tworzą antykodon, komplementarny do trójnukleotydowego kodonu
określonego aminokwasu, znajdującego się w sekwencji kodującej mRNA. Obec-
ność inozyny w antykodonie umo\liwia cząsteczce tRNA rozpoznawanie więcej
ni\ jednego kodonu.
RamiÄ™ zmienne (dodatkowe) jest najbardziej zmiennym elementem
w strukturze poszczególnych cząsteczek tRNA. Mo\e mieć ró\ną długość, od bar-
dzo słabo zaznaczonej, składającej się z 3 nukleotydów do długiego ramienia utwo-
rzonego a\ z 21 nukleotydów. Długie ramię zmienne mo\e zawierać rejon sparo-
wany, składający się z 7 par nukleotydów.
RamiÄ™ T¨
¨C, skÅ‚adajÄ…ce siÄ™ z 5 par nukleotydów sparowanych zakoÅ„czone
¨
¨
jest pÄ™tlÄ… T¨
¨C, utworzonÄ… z 7 niesparowanych nukleotydów, wÅ›ród których nie-
¨
¨
zmiennymi nukleotydami sÄ… GT¨C.
Większość niezmiennych nukleotydów znajduje się w pętlach i nie ma istot-
nego znaczenia w tworzeniu struktury drugorzędowej, lecz biorą udział w tworze-
niu trzeciorzędowych wiązań wodorowych, które stabilizują strukturę trzeciorzę-
dową tRNA. Tworzenie komplementarnych par między nukleotydami niezmien-
nymi pÄ™tli DHU i pÄ™tli T¨C umo\liwia czÄ…steczce tRNA przybranie konformacji
przestrzennej (struktury III-rzędowej), przypominającej odwróconą literę L, zawie-
rającą na jednym końcu (dłu\szym) antykodon, a na drugim (krótszym) miejsce
akceptorowe dla aminokwasu.
Wszystkie dojrzałe tRNA powstają z dłu\szych pierwotnych transkryptów,
tzw. pre-tRNA, w procesie dojrzewania. Reakcje składające się na proces dojrze-
wania tRNA u eukariota polegają na 1) odcięciu sekwencji liderowej z końca 5';
2) odcięciu dwóch nukleotydów z końca 3'; 3) dodaniu do końca 3' sekwencji CCA;
4) wycięciu centralnego intronu z cząsteczki pre-tRNA; 5) chemicznych modyfika-
cjach zasad azotowych. Procesy te katalizujÄ… egzonukleazy i endonukleazy (RNazy
D, E, F, P) oraz enzymy modyfikujące zasady. RNaza P jest endonukleazą, składa-
jącą się z jednej cząsteczki RNA i jednej białka (jest więc RNP), za aktywność
katalityczną odpowiedzialna jest cząsteczka RNA (rybozym), która przeprowadza
dojrzewanie końca 5' tRNA.
Rybozymy to katalityczne czÄ…steczki RNA, czyli biokatalizatory, zdolne do
katalizowania chemicznej reakcji w nieobecności białka. W przypadku RNazy P,
jej składnik białkowy przypuszczalnie pomaga katalizować reakcję in vivo, ponie-
336
wa\ in vitro rybozym RNazy P wymaga większego stę\enia jonów Mg2+ od stę\e-
nia magnezu obecnego w komórkach.
rRNA
Rybosomalne RNA są jednoniciowymi polirybonukleotydami, występują-
cymi w komórkach jako główne składniki rybosomów oraz jąderka. Stanowią oko-
ło 80% komórkowego kwasu rybonukleinowego. Masa cząsteczkowa większości
rRNA jest bardzo du\a, poniewa\ pojedyncza cząsteczka mo\e zawierać kilka ty-
sięcy nukleotydów, z wyjątkiem nielicznych, których pojedyncza cząsteczka po-
siada 121 lub 158 nukleotydów.
CharakterystycznÄ… modyfikacjÄ™ chemicznÄ… dla czÄ…steczek rRNA stanowi
metylacja, wykryto 24 swoiste metylacje zasad azotowych, przy czym grupa mety-
lowa dodawana jest głównie do pierścienia adeniny. Ponadto, często obserwuje się
metylację prowadzącą do 2'-O-metylorybozy, która mo\e zachodzić w ponad 100
miejscach cząsteczki rRNA. Reakcje metylacji, zachodzące w jądrze komórko-
wym, przeprowadzają niskocząsteczkowe cząstki RNP, których snRNA są kom-
plementarne do rejonów rRNA, z którymi tworzą pary, definiując w ten sposób
miejsca metylacji. Aktywnym donorem grup metylowych jest S-adenozylometio-
nina.
Struktura drugorzędowa wszystkich cząsteczek rRNA wyró\nia się obecno-
ścią sparowanych rejonów dwuniciowych, tzw. ramion, poprzedzielanych rejona-
mi niesparowanymi, jednoniciowymi, tzw. pętlami. Obecność w
5
3
PTLE
RAMIONA
polirybonukleotydzie rejonów ramion i pętli sprzyja specyficznym oddziaływa-
niom i wiązaniu białek, tym samym tworzeniu kompleksów rybonukleoproteino-
wych RNP, mających istotne znaczenie w formowaniu rybosomów.
337
W komórkach eukariotycznych występują 4 rodzaje rRNA. Wielkocząstecz-
kowy rRNA, którego łańcuch polirybonukleinowy tworzy 4718 nukleotydów,
określa się jako 28S rRNA.
[Wielkość S (Swedberg) jest liczbową wartością współczynnika sedymentacji (s),
zdefiniowanego szybkością, z jaką makrocząsteczki sedymentują (opadają) w polu
wirowania (przyspieszenia odśrodkowego, tysiąckrotnie większego od pola grawi-
tacji ziemskiej), osiąganego w ultrawirówkach. Wartości S są nieaddytywne, po-
niewa\ zale\ą od masy i kształtu cząsteczki.]
Mniejszą cząsteczką jest 18S rRNA, która składa się z 1874 reszt nukleoty-
dowych. NiskoczÄ…steczkowe rRNA sÄ… dwa, jeden z nich, mianowicie 5,8S rRNA
(składający się z 158 nukleotydów), występuje tylko u eukariota, drugi natomiast,
5S rRNA (składający się z 121 nukleotydów), poza tym, \e jest obecny w komór-
kach eukariotycznych, charakterystyczny jest równie\ dla komórek prokariotycz-
nych. W komórkach prokariotycznych występują 3 rodzaje rRNA, mianowicie:
23S rRNA, 16S rRNA i 5S rRNA.
Dojrzałe cząsteczki rRNA powstają z pierwotnego transkryptu pre-rRNA,
pojedynczego długiego prekursora, w wyniku serii modyfikacji i cięć w tzw. ze-
wnętrznych transkrybowanych sekwencjach lub wewnętrznych transkrybowanych
sekwencjach rozdzielających, składających się na proces dojrzewania. W komór-
kach ssaków pierwotny transkrypt o wielkości rzędu 13 500 nukleotydów zawiera
po jednej kopii 18S rRNA, 5,8S rRNA i 28S rRNA. Natomiast eukariotyczny 5S
rRNA powstaje z odrębnego genu w procesie transkrypcji katalizowanej przez
polimerazę RNA (III), odmienną od polimerazy RNA (I), która transkrybuje pre-
rRNA dla trzech pozostałych rybosomalnych kwasów rybonukleinowych. Proces
dojrzewania transkryptu 5S rRNA jest znacznie ograniczony lub te\ nie zachodzi
wcale. Wszystkie trzy prokariotyczne rRNA transkrybowane sÄ… przez jednÄ… poli-
merazę RNA III w formie pojedynczej nici pierwotnego transkryptu, na której
znajdują się równie\ sekwencje pre-tRNA.
Proces dojrzewania pre-rRNA katalizowany jest enzymatycznie, w tym rów-
nie\ przez rybozymy. Udowodniono (przynajmniej u jednego przedstawiciela eu-
kariota), \e występujący w pre-rRNA u Tetrahymena termophila intron przepro-
wadza autokatalityczny splicing. W układzie in vitro intron ten wymaga kofaktora,
którym jest guanozyna lub jej ufosforylowane pochodne, natomiast zupełnie nie
potrzebuje obecności białek do wycięcia się z prekursora. Intron ten spełnia kryte-
ria typowego rybozymu. Rybozym ten, poza własnością samowycinania, posiada
zdolność katalizowania ligacji uwolnionych fragmentów rRNA. Rybozymy, czyli
katalityczne, krótkie cząsteczki RNA, charakteryzują się minimalnymi wymogami
sekwencyjnymi, koniecznymi do ujawnienia swych własności. Fakt ten stał się
podstawą konstruowania syntetycznych rybozymów, które mogą rozcinać inne
cząsteczki RNA, w nadziei, \e będzie mo\na je stosować w terapii, do inaktywacji
odpowiednich mRNA, wirusów i do zabijania komórek nowotworowych.
338
Dojrzewające cząsteczki rRNA zwijają się w przestrzeni, łączą się z białka-
mi rybosomowymi, podlegajÄ…c samoorganizacji prowadzÄ…cej do wytworzenia ry-
bosomów. Oznacza to, \e informacje o strukturze rybosomów są zawarte w struk-
turze ich składników.
Rybosomy to typowe RNP, czyli kompleksy rybonukleoproteinowe o ol-
brzymiej masie czÄ…steczkowej, rzÄ™du 2,75 Å" 106 daltonów u prokariota (70 S) i rzÄ™-
du 4,5 Å" 106 daltonów u eukariota (80 S). Ka\dy rybosom skÅ‚ada siÄ™ z dwóch pod-
jednostek, większej i mniejszej.
Rybosomy eukariotyczne w swej du\ej podjednostce (o wielkości 60S,
czyli 3 Å" 106 Da) zawierajÄ… trzy rodzaje rRNA (28S, 5,8S, 5S) i okoÅ‚o 45 ró\nych
biaÅ‚ek, natomiast w maÅ‚ej podjednostce (o wielkoÅ›ci 40S, czyli 1,5 Å" 106 Da) jeden
rodzaj rRNA (18S) oraz około 30 ró\nych białek.
Rybosomy prokariotyczne w swej du\ej podjednostce (o wielkości 50S,
czyli 1,7 Å" 106 Da) zawierajÄ… dwa rodzaje rRNA (23S, 5S) oraz okoÅ‚o 31 ró\nych
biaÅ‚ek, natomiast w maÅ‚ej podjednostce (o wielkoÅ›ci 30S, czyli 0,95 Å" 106 Da) jeden
rodzaj rRNA (16S) oraz około 21 ró\nych białek.
Własności chemiczno-fizyczne kwasów nukleinowych
Cząsteczki DNA są bardzo długie w porównaniu do swej średnicy i stosun-
kowo sztywne, dlatego roztwory ich mają du\ą lepkość.
Kwasy nukleinowe wykazują ró\ną wra\liwość na środowisko zasadowe
i kwasowe.
Cząsteczki DNA są odporne na działanie mocnych zasad. Pozostawienie
DNA w roztworze 1M NaOH przez 20 40 godzin w temperaturze 37°C nie dostar-
cza \adnych produktów hydrolizy zasadowej. W tych warunkach RNA rozpada się
całkowicie do mieszaniny 2 - i 3 - monofosfonukleozydów. Następuje to dzięki
obecności grupy OH przy atomie C2' rybozy, która w środowisku zasadowym
uczestniczy w tworzeniu nietrwałych wewnątrzcząsteczkowych wiązań fosfodie-
strowych w cyklicznych nukleozydo-2 ,3 -fosforanach. WiÄ…zania te rozpadajÄ… siÄ™
z równym prawdopodobieństwem do nukleozydo-2 - i nukleozydo-3 -fosforanów.
Brak grupy OH przy atomie C2' deoksyrybozy uniemo\liwia powstanie cyklicz-
nych fosforanów nukleozydów i jest podstawą oporności kwasów deoksyrybonu-
kleinowych na działanie zasad.
Hydroliza kwasowa kwasów nukleinowych dostarcza ró\nych produktów
zale\nie od stę\enia stosowanych kwasów, czasu trwania hydrolizy i temperatury.
Wiązania glikozydowe ró\nią się wra\liwością na działanie kwasów, mianowicie:
w nukleotydach purynowych wiÄ…zania glikozydowe sÄ… bardziej labilne ni\ w nu-
kleotydach pirymidynowych.
339
KrótkotrwaÅ‚e ogrzewanie (w 100°C), zarówno DNA, jak i RNA z kwasami
(np. HCl) o niskich stę\eniach (ok. 1M) początkowo dostarcza kwasów apuryno-
wych, będących łańcuchami polinukleotydowymi, pozbawionymi zasad puryno-
wych. W dalszym etapie tej hydrolizy kwasowej (po 1 godz.) powstajÄ… mononu-
kleotydy pirymidynowe, pentozy i kwas fosforowy.
Pod wpływem działania mocnych kwasów mineralnych (np. 72% roztwór
HClO4) i podwy\szonej temperatury (100°C przez 1 godz.) zarówno z DNA, jak
i z RNA uwolnione zastajÄ… zasady purynowe oraz pirymidynowe, pentozy, a tak\e
kwas fosforowy, tym samym ulegają całkowitej hydrolizie.
Hydroliza enzymatyczna kwasów nukleinowych polega na rozkładzie ich
wiązań fosfodiestrowych przez enzymy z grupy endo- lub egzo- rybonukleaz lub
deoksyrybonukleaz. W zale\ności od rodzaju uczestniczącego w reakcji enzymu
powstają ró\ne produkty, nukleozydo-5'-monofosforany lub nukleozydo-3'-mono-
fosforany. Uwolnienie zasad azotowych z połączeń glikozydowych przeprowadza-
jÄ… specyficzne nukleozydazy.
Szczególną grupę endonukleaz stanowią enzymy restrykcyjne, zwane re-
stryktazami. Są to enzymy syntetyzowane przez ró\norodne szczepy bakterii, któ-
rych zadaniem jest degradacja obcego (np. wirusowego) DNA w komórce bakte-
ryjnej. Enzymy te charakteryzują się prawie absolutną specyficznością, rozpoznają
w nici DNA sekwencję, zazwyczaj 4 8 nukleotydową, w obrębie której rozcinają
specyficzne wiÄ…zanie fosfodiestrowe. W genomie bakteryjnym sekwencje te zwy-
kle sÄ… metylowane na reszcie adeniny lub cytozyny, co zabezpiecza DNA gospoda-
rza przed degradacją przez własne enzymy restrykcyjne. Enzymy restrykcyjne
rozpoznajÄ… i rozszczepiajÄ… sekwencje palindromowe w DNA. Sekwencja palin-
dromowa dwuniciowego DNA to taka sekwencja nukleotydów, która jest identycz-
na, gdy odczytuje się ją na obu niciach w kierunku 5'3'. Niektóre restryktazy,
w wyniku hydrolizy DNA, dostarczają fragmenty zakończone jednoniciowymi
sekwencjami, zwanymi potocznie końcami kohezyjnymi . Końce kohezyjne frag-
mentów DNA wytworzonych skutkiem działania tego samego enzymu restrykcyj-
nego są zawsze komplementarne do siebie, niezale\nie od zródła pochodzenia pre-
paratu DNA poddawanego hydrolizie. Takie produkty hydrolizy DNA mo\na połą-
czyć ze sobą na zasadzie komplementarności poprzez jednoniciowe końce kohe-
zyjne. Fakt ten sprawił, \e enzymy restrykcyjne stały się wa\nym narzędziem
w biologii molekularnej, umo\liwiajÄ…cym nie tylko wycinanie, ale i Å‚Ä…czenie frag-
mentów DNA w rekombinowane cząsteczki.
Denaturacja i renaturacja DNA
Proces denaturacji kwasów nukleinowych polega na zniszczeniu ich struktu-
ry II- i III-rzędowej. Czynnikami denaturującymi DNA są: wysoka wartość pH,
alkohole, fenole, wysoka temperatura, ultradzwięki, promieniowanie.
340
Związkami powszechnie stosowanymi w analizie kwasów nukleinowych
w celu spowodowania denaturacji kwasów nukleinowych są formamid (HCONH2)
i mocznik (H2NCONH2). Związki te powodują rozrywanie wiązań wodorowych
większości cząsteczek wody i wykluczają umiejscawianie się wody pomiędzy za-
socjowanymi warstwowo hydrofobowymi zasadami azotowymi, doprowadzajÄ…c do
denaturacji dwuniciowych struktur kwasów nukleinowych.
Wpływ środowiska zasadowego polega na zmianie tautomerycznych form
zasad azotowych w kwasach nukleinowych, w kierunku form enolowych (lakty-
mowych), poniewa\ czÄ…steczka traci proton, a Å‚adunek ujemny jest stabilnie zloka-
lizowany na atomie tlenu. Ma to wpływ na wiązania wodorowe między parami
zasad azotowych, powodujÄ…c ich rozerwanie, tym samym zniszczenie dwuniciowej
struktury DNA, czyli jego denaturacjÄ™.
Pod wpływem ogrzewania struktura podwójnej helisy DNA ulega podobne-
mu zniszczeniu i rozpada siÄ™ na pojedyncze nici. Rozpad struktury helikalnej na-
stępuje w określonej temperaturze, zwanej temperaturą topnienia DNA.
Temperatura topnienia (Tm) określonych cząsteczek DNA, to taka wartość,
przy której dochodzi do utraty połowy helikalnej struktury DNA, z towarzyszącym
nagłym wzrostem pochłaniania światła w ultrafiolecie (przy 260 nm). Na przed-
temp.
75 80 85
stawionym powy\ej wykresie temperatura topnienia analizowanego preparatu
DNA wynosi 85°C. Jej wartość zale\y od skÅ‚adu zasad azotowych DNA, miano-
wicie im wy\sza zawartość par CG, tym wy\sza temperatura topnienia.
341
Zmiana absorbancji przy 260 nm
100
80
60
40
20
0
70 80 90 100 110
temperatura topnienia
Denaturacja jest odwracalna, po usunięciu czynnika denaturującego, ma
miejsce odtworzenie komplementarnej struktury podwójnej helisy DNA, a proces
ten nazywa siÄ™ renaturacjÄ….
Zdenaturowany DNA w temperaturze nieco ni\szej od temperatury topnie-
nia, po powolnym schładzaniu w temperaturze pokojowej ulega prawie całkowitej
renaturacji do struktury dwupasmowej. Szybkość renaturacji wyra\a się jako ilo-
czyn stÄ™\enia (mol/l) i czasu (s), u prokariota zazwyczaj jest odwrotnie proporcjo-
nalna do wielkości genomu. Jednocześnie szybkość renaturacji DNA okazuje się
tym większa, im wy\sza zawartość w nim powtarzających się sekwencji, np. mysi
satelitarny DNA (10% mysiego DNA) renaturuje w ciÄ…gu kilku sekund, znacznie
szybciej od najmniejszych czÄ…steczek DNA (np. faga T4, lub E.coli). Natomiast
DNA zawierajÄ…cy sekwencje unikatowe, nie powtarzajÄ…ce siÄ™ (np. 70% mysiego
DNA) renaturuje bardzo wolno. Podczas renaturacji łączenie w podwójne helisy
pojedynczych łańcuchów polinukleotydowych, pochodzących z ró\nych kwasów
nukleinowych (zarówno typu DNA-DNA, jak i DNA-RNA), nazywa się hybrydy-
zacją. Tworzenie hybryd jest mo\liwe między podobnymi (spokrewnionymi) łań-
cuchami polinukleotydowymi, które na długich odcinkach cząsteczki mają kom-
plementarne sekwencje zasad azotowych. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
wykorzystywana jest jako metoda w biologii molekularnej.
342
Zawarto
ść
GUANINY + CYTOZYNY (%)
A
A
0C
dsDNA
0C
0
C
ssDNA
Denaturacja i renaturacja termiczna DNA
Spektroskopowe właściwości kwasów nukleinowych
Kwasy nukleinowe, podobnie jak nukleotydy, nukleozydy i zasady azotowe,
selektywnie pochłaniają światło w nadfiolecie (UV), z maksimum przypadającym
na 260 nm. Właściwość ta wynika z obecności w omawianych związkach układów
aromatycznych: purynowego i pirymidynowego, zawierajÄ…cych sprzÄ™\one wiÄ…za-
nia podwójne oraz heteroatomy.
343
Zdolność kwasów nukleinowych do absorpcji światła wykorzystuje się do
wykrywania, ilościowego oznaczania oraz określania stopnia czystości preparatów
kwasów nukleinowych.
Absorbancja kwasów nukleinowych nie jest addytywną sumą absorbancji
wszystkich zasad azotowych, wchodzących w ich skład, rzeczywista molowa
absorpcja okazuje się ni\sza o około 40% od wartości teoretycznie obliczonej na
podstawie składu. Zjawisko to nosi nazwę efektu hipochromowego, który wynika
z helikalnego uporzÄ…dkowania przestrzennego nici polinukleotydowych, opisanego
strukturą drugorzędową i trzeciorzędową.
Widma absorpcyjne kwasów rybonukleinowych i deoksyrybonukleinowych
sÄ… bardzo podobne. Absorbancja przy 260 nm jest najmniejsza dla dwuniciowego
DNA (dsDNA), większa dla jednoniciowego DNA (ssDNA) lub RNA i największa
dla wolnych nukleotydów.
jednoniciowy
dwuniciowy
220 260 300 nm
CzÄ…steczki jednoniciowe DNA sÄ… produktami denaturacji dwuniciowych
cząsteczek DNA i silniej absorbują światło o długości fali 260 nm ni\ cząsteczki
dwuniciowe DNA. Zjawisko to nosi nazwę efektu hiperchromowego, który jest
konsekwencjÄ… obni\enia uporzÄ…dkowania przestrzennego nici polinukleotydowych.
Wielkość efektu hiperchromowego jest proporcjonalna do ilości nukleoty-
dów znajdujących się w obrębie helikalnych fragmentów cząsteczki, które uległy
w tym procesie zniszczeniu. Renaturacji całkowitej DNA do struktury dwupasmo-
wej towarzyszy efekt hipochromowy. Szybkie schłodzenie zdenaturowanego pre-
paratu DNA, raczej utrwala struktury jednoniciowe. Takie ssDNA mogą splatać się
swymi krótkimi regionami komplementarnymi pojedynczej nici, w nieznacznym
natomiast stopniu powstajÄ… dwuniciowe struktury, stabilizowane wiÄ…zaniami wo-
dorowymi, dlatego w tych warunkach efekt hipochromowy jest raczej niewielki.
344
A b s o r b a n c j a
Denaturacji i renaturacji DNA, poza zmianą absorpcji światła w ultrafiole-
cie, towarzyszą zmiany innych własności fizycznych, jak lepkość i skręcalność
optyczna.
Własności spektroskopowe makrocząsteczek pozwalają określić przybli\oną
czystość preparatów kwasów nukleinowych, na podstawie wartości stosunku
absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/A280). Wolny od zanieczyszczeń dwuni-
ciowy DNA ma wartość współczynnika A260/A280 równą 1,8, czysty RNA około 2,
czyste białka poni\ej 1 (około 0,5). Preparat DNA, którego wartość współczynnika
A260/A280 jest większa od wartości 1.8, mo\e być zanieczyszczony RNA. Jeśli
współczynnik A260/A280 ma wartość poni\ej 1.8, to preparat zanieczyszczony mo\e
być białkami.
345
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Kwasy nukleinoweKwasy nukleinowe 2Związki heterocykliczne i kwasy nukleinowecw 11 kwasy nukleinoweBW13 KWASY NUKLEINOWEkwasy nukleinowe 2Kwasy nukleinowekwasy nukleinowe materialykwasy nukleinowekwasy nukleinowe wyklad inauguracyjnykwasy nukleinowe i enzymykwasy nukleinowenukleotydy i kwasy nukleinowewięcej podobnych podstron