img283
78 Dorota Hoja-Łukowicz
.Współcżyhinikik j est wielkością charakterystyczną dla danej substancji absorbującej, stalą dla danej długości fali i równą liczbowo wartości absorpcji roztworu o stężeniu jednostkowym i jednostkowej grubości warstwy.
Roztwory białek wykazują charakterystyczne maksimum absorpcji w zakresie UV przy długościach fali od.2^0 .do. 2.9,0,jjm (zwykle odczytu absorbancji dokonuje się przy X = .2,80 nip) co wynika z obecności aminokwasów aromatycznych (Tyr, Trp, i’he). Umożliwia to oznaczenie stężenia białek w roztworach. W tym samym zakresie UV absorbują również inne związki, głównie kwasy nukleinowe i nukleotydy. W roztworze białka położenie maksimum absorbancji UV zależy od pH roztworu białka oraz zawartości w nim reszt Tyr, Trp i Phe.
W zmodyfikowanej metodzie spektrofotometrycznej stężenie białka w próbce określa się na podstawie różnicy absorbancji mierzonych przy długościach fali 235 i 280 nm:
(2) stężenie białka (mg/ml) = (AJJS - A2!0)/2.51
gdzie: współczynnik 2.51 jest różnicą pomiędzy średnią wartością współczynnika ekstynkcji (E0J%) w 235 i 280 nm.
Zalety: Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna umożliwia określenie stężenia białka w próbce bez korzystania z odnośnika białkowego i krzywej kalibracyjnej; eliminuje wkład kwasów nukleinowych w wartość mierzonej absorbancji (kwasy nukleinowe dają tę samą absorbancję przy 280 i 235 nm); jest niezależna od specyfiki składu aminokwasowego białka; pomiaru absorbancji przy wymienionych dwóch długościach fali można dokonać w tej samej próbce.
Wady: Zmodyfikowana metoda spektrofotometryczna wykazuje 45% czułości metody Low-iy’ego. Dla białek o specyficznym składzie aminokwasowym konieczne jest wykonanie krzywej kalibracyjnej.
15.1.3.1. Materiały
Próbka - 1 ml roztworu białka (BSA) o stężeniu w przedziale 1 - mg/ml
15.1.3.2. Aparatura i sprzęt laboratoryjny Spektrofotometr, kuweta kwarcowa o pojemności 1 ml
15.1.3.3. Wykonanie
Zmierzyć wartość absorbancji badanej próbki przy długościach fali 235 i 280 nm.
15.1.3.4. Opracowanie wyników
Korzystając ze wzoru (2), obliczyć stężenie białka w badanej próbce.
15.1.4. Określanie aktywności enzymatycznej białka
Według zaleceń Komisji Enzymatycznej z 1961 roku jednostką standardową enzymu ozna1-czoną symbolem f (ang.S®) jest taka jego ilość, która katalizuję przemianę 1 rnikromola sujt-stratu,(lub 1 mikromola odpowiednich grup chemicznych) w .ciągu_1 minuty w warunkach optymalnych (w środowisku o stężeniu jonów wodorowych, w którym enzyrnwykazuje mak-symalną.aktywność i w obecności.wszystkich potrzebnych kofaktorów,w odpowiednich stężę-niach) przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu i w temperaturze 30°C (miano:;jpmoVmit§. Stopień czystości preparatów enzymatycznych określa aktywność właściwa, tzn. liczba jednostek standardowych przypadająca na 1 mg białka (J/mg). Dla maksymalnie oczyszczonych homogenicznych preparatów można wyznaczyć aktywność molekularną, tj. liczbę cząsteczek substratu przekształconych w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu w warunkach optymalnych. Wielkość tę można wyrazić liczbą jednostek standardowych przy-padającąna 1 mikromol enzymu (J/pmol). Posiada ona miano 1/min (ponieważ J wyraża się w pmol/min).
Według zmian Komisji Enzymowej Międzynarodowej Unii Biochemicznej z 1972 roku, jednostką enzymatycznąjest ta aktywność enzymu, która przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 sekundy. Jednostkę tę nazwano katalerii;(k'ąt); jej mianem jest mol/s, a pochodnymi sąmi-krokatal (10 ć kat) i nanokatal (10~9 kat). Aktywność właściwą wyraża się w mikrokatalach na kilogram białka (pkat/kg). Zależność liczbowa między starymi i nowymi jednostkami jest następująca:
lkat = 1 mol/s = 6 • 107 J 1 J = 1 pmol/min = 16 • 67 ■ 10 9 kat
15.1.4.1. Materiały
Frakcja lizosomowa wątroby 3-miesięcznych szczurów
15.1.4.2. Aparatura i sprzęt laboratoryjny
Spektrofotometr (SPEKOL 221), probówki, statyw na probówki, łaźnia wodna, czasomierz, pipety nastawne
15.1.4.3. Odczynniki
Bufor octanowy (0.3 M CH3COONa/CH3COOH pH 4.5), substrat (3 mM (3-D-glukuronid fenoloftaleiny), stoper (0.5 M glicyna-NaOH pH 10.4)
15.1.4.4. Wykonanie
Przygotować 10-, 50- i 100-krotne rozcieńczenia frakcji lizosomowej wątroby szczura. Z każdego rozcieńczenia odpipetować do oddzielnych probówek po 30 pi każdej próbki, dodać 100 pl buforu octanowego pH 4.5 i 30 pl substratu. Inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut. Reakcję enzymatyczną zatrzymać, dodając 0.8 ml stopera. Stężenie przekształconego substratu mierzyć w specolu przy X = 555nm i k = 884 wobec ślepej odczynnikowej. Odczyt ten jest wyrażony w nmol/ml. Po uwzględnieniu czasu inkubacji i przeliczeniu go na 1 s otrzymujemy nkatale.
Uwaga: Oznaczenia aktywności P-glukuronidazy wykonać w 2 równoległych powtórzeniach.
15.1.4.5. Opracowanie wyników Obliczyć aktywność enzymu w nkat.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
img283 78 Dorota Hoja-Łukowicz -Współczynnrkikjest wielkościącharakterystycznądla danej substancji
skanuj0001 gdzie: c - molowy współczynnik absorpcji [wielkość charakterystyczna dla danej substancji
biotermo5 2. Potencjał chemiczny - jest to wielkość charakterystyczna dla danej substancji, określa
img285 82 Dorota Hoja-Łukowicz Chromatografię powinowactwa stosuje się do: - oczys
img286 84 Dorota Hoja-Łukowicz działu chromatograficznego rozpoczyna się zaraz po nałożeniu próbki.
img282 76 Dorota Hoja-Łukowicz Redukcja kwasu fosfomolibdenowego zachodzi szybko w środowisku o pH 1
img284 80 Dorota Hoja-Łukowicz Literatura Bradford M.M.: A rapid and sensitive method for the quanti
P1020598 Współczynnik załamani światła, n, jest wielkością charakterystyczną dla danego
P1020598 Współczynnik załamani światła, n, jest wielkością charakterystyczną dla danego
P1020598 Współczynnik załamani światła, n, jest wielkością charakterystyczną dla danego
Współczynnik załamania wielkość charakteryzująca zjawisko załamania fali elektromagnetycznej,
- współczynnik sedymentacji - wielkość charakteryzująca
page0088 78 że ta atrybucya nie jest koniecznie charakterystyczna dla zjawisk duchowych, gdyż zdarza
więcej podobnych podstron