02

2.    Dokonać pomiaru absorbancji przy ). = 260 i 280 nm.

3.    Obliczyć stosunek /4₂₆₀M₂₈₀; jeżeli wartość tego stosunku jest zbliżona do 1,8 dli DNA lub do 2,0 dla RNA, to można oszacować ilość DNA lub RNA, korzystając z tego, że A₂₆₀ = 1 odpowiada 50 pg/ml dwuniciowego DNA i 40 pg/ml RNA.

Uwagi:

1)    Metoda ta pozwala oszacować ilość kwasów nukleinowych bez rozróżnienia pomiędzy DNA i RNA, dlatego też należy brać pod uwagę, że gdy bada się preparal DNA zawierający znaczące ilości RNA — lub odwrotnie, to oszacowanie jest obarczone większym błędem niż w przypadku jednorodnego preparatu, oraz że otrzymana wartość absorbancji dotyczy obydwu kwasów.

2)    Zamiast buforu TE (odcz. I) można zastosować inny bufor lub H₂0.

3)    Szacując ilość kwasów nukleinowych należy pamiętać, że relacje między wartościami absorbancji i stężenia podane są dla drogi optycznej równej 1 cm, odpowiadającej standardowym kuwetom; stosując kuwety o skróconej długości drogi optycznej należy brać po uwagę zmniejszenie wartości absorbancji odpowiadające danemu stężeniu. Jeśli zastosowano kuwety o długości drogi optycznej n [cm], wartość absorbancji należy podzielić przez n. Przykład: z pomiaru absorbancji w kuwecie o długości drogi optycznej 0,5 cm otrzymano wartość 0,237. Zakładamy, że badany preparat jest preparatem czystego DNA, wówczas stężenie DNA w próbce (c) wynosi:

50 pg/ml- 0,237 0^5

Ćwiczenie 10.34. Fluorescencyjne analizy ilościowe kwasów nukleinowych (J. Samb-

rook i wsp. 1989: Molecular cloning. A laboratory manuał. Book 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, E.5-E.7)

Jeśli stężenie DNA jest tak małe, że nie można zastosować spcktrofotometrycznci analizy ilości DNA (zazwyczaj poniżej 250 ng/ml) lub DNA jest w poważnym stopniu zanieczyszczony substancjami absorbującymi promieniowanie UV, to szybkim sposobem oceny ilości DNA jest wykorzystanie fluorescencji wywołanej światłem UV przez cząsteczki bromku etydyny interkalujące pomiędzy sąsiednie pary zasad DNA. Natężenie fluorescencji jest proporcjonalne do całkowitej masy DNA, wobec tego ilość DNA w próbce można określić przez porównanie natężenia fluorescencji w próbce z natężeniem fluorescencji próbki o znanej ilości DNA (standardu) lub lepiej zbioru takich próbek o różnej zawartości DNA. Tymi metodami można badać próbki zawierające I 5 ng DNA. Dalsze informacje dotyczące analizy fluorescencyjnej kwasów nukleinowych podano w pod-rozdz. 10.2.2.

Zasada: W ćwiczeniu porównuje się wizualnie natężenie fluorescencji bromku etydyny związanego z DNA w badanej próbce z natężeniem fluorescencji szeregu próbek wzorcowych.

432

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
IMAG0163 >Ocena spektroforetyczna DNAilościowa stosunek absorbancji przy X = 260 nm do absorbancj
3) dokonać pomiarów rezystancji badanych oporników omomierzem i porównać z obliczeniami wykonan
Egzamin probny pisemny 03 2011 str 5 KiMYDKOtittliUfAMINł MJ-.Srt.ATlS: Cl KiMYDKOtittliUfAMINł MJ
poprzez pomiar absorbancji w nadfiolecie (310nm, 320 nm) roztworów o różnych stężeniach początkowych
Przy A,max dokonaj pomiaru ekstynkcji (absorbancji) dla dziesięciu roztworow siarczanu miedzi o stęż
35
2 teK> .TCi WS.C    ćząAośclomeYza ustawionego na pomiar okresów przy
02 T dE/dt —f(E) zależą od liczby par G-C w cząsteczce DNA, przy czym im większa zawartość par G-C,
07 na wyeluowaniu rozdzielonych związków z bibuły i spektrofotometrycznym pomiarze absorbancji w od
04 octowego, inkubowanych w temp. 25-35cC przez 15 godz. Powstały barwny roztwór wykazuje maksimum
sekwencji możliwe jest dokonanie pomiaru dla większej liczby komórek przy wykorzystaniu jednej
ogolna w terenowe07 7. Dokonać pomiaru głębokości orki bruzdomierzem i przy użyciu metalowego 
pomocą spektrofotometru dokonano pomiaru dokonano pomiaru ekstynkcji próbki badanej przy długości fa
DSCF2111 (2) 52 -    dokonać pomiarów i rejestracji składowych Fy i

więcej podobnych podstron