img111 3
Ćwiczenie 4.33. l/olowiinie białek surowicy wiążących jony motali (J. Porath i wsp 1975: Naturę, 258:598 599)
Zasada: Większość cząsteczek białkowych w różnym stopniu oddziałuje z jonami metali. Siła tego oddziaływania zależny od struktury przestrzennej cząsteczki (donic ny wiążące jony metali), od zawartości reszt aminokwasowych, które bezpośrednio mogą wiązać jony metali (His, Trp i Cys) oraz od pił otoczenia (optimum w przedziale pH 6 8). Elucję specyficznie zaadsorbowanego materiału umożliwia obniżenie pH i jednoczesne zwiększenie siły jonowej eluentu lub zastosowanie do clucji silnego chelatora jonów dwuwartościowych — EDTA.
Materiał: Surowica krwi człowieka lub świni.
Odczynniki:
1) Chclating Scpharosc 6B.
2) 20 mM bufor fosforanowy (pH 7,0).
3) I mg/ml CuS04 w buforze fosforanowym (pH 7,0).
4) 100 mM bufor cylrynianowy - 100 mM NaCI (pH 6,0).
5) 100 mM bufor cylrynianowy - 400 mM NaCI (pH 5,0).
6) 100 mM bufor cylrynianowy - 700 mM NaCI (pH 4,0).
7) I (X) mM bufor cylrynianowy - 1 M NaCI (pH 3,0).
8) Roztwór: 50 mM EDTA - I M NaCI.
9) 20% roztwór etanolu.
Wykonanie: Pobrać 5 ml złoża i upakować w plastikowej kolumnie (10-15 ml) /łoże przemyć wodą destylowaną (50 ml), a następnie buforem fosforanowym o pil 7,0 (50 ml). Przepuścić przez kolumnę roztwór CuS04 (odcz. 3; 20 ml) w celu związania jonów miedzi ze złożem. W wyniku tego zabiegu złoże powinno zmienić barwę z białej na niebieską. Nadmiar jonów miedzi usunąć przemywając kolumnę buforem fosforanowym (20 ml). Surowicę krwi (10 ml) rozcieńczyć 10-krotnic buforem fosforanowym i przepuścić przez kolumnę. Niespecyficznie zaadsorbowanc białka usunąć z kolumny przez ponowne przemycie jej buforem fosforanowym (50 ml). Stosując kolejno bufory cytrynianowe o malejącej wartości pH i rosnącej sile jonowej (50 ml każdego z buforów), cluować z kolumny białka związane z jonami miedzi. Jony miedzi związane ze złożem oraz silnie związane z nimi białku usunąć z kolumny za pomocą 50 ml roztworu: 50 mM EDTA - 1 M NaCI Wypływający z kolumny materiał zbierać w 2-mililitrowych frakcjach i metodą spcktrofotometryczną (/. = 280 nm) oznaczyć frakcje zawierające białko. Kolumnę przemyć wodą destylowaną (50 ml) oraz użyć ponownie lub zakonserwować 20% etanolem (30 ml) i przechowywać w temp. 4°C.
4.8. CHROMATOGRAFIA WYKORZYSTUJĄCA HYDROFOBOWE WŁAŚCIWOŚCI CZĄSTECZEK
Zdecydowana większość makromolekuł ma na tyle skomplikowaną strukturę we wnętrzną. że można w nich wyróżnić zarówno obszary hydrofilowe eksponowane na zewnątrz cząsteczki w polarnym otoczeniu wody, jak i obszary hydrofobowe
ukryte we wnętrzu cząsteczki znajdującej się w środowisku wodnym i eksponowane na zewnątrz po zmianie środowiska n.i nicpolarne. Wielkocząstcczki różnią się zarówno ilością takich obszarów hydrofobowych, jak i ich umiejscowieniem w strukturze cząsteczki, co umożliwia ich rozdział ze względu na odmienne właściwości hydrofobowe. Dalej omówiono dwie główne techniki rozdziału makromolckuł ze względu na ich hydrofobowość. Obie wykorzystują hydrofobowe właściwości ligandów trwale umocowanych na powierzchni nośnika, a różnią się głównie składem fazy ruchomej przepływającej przez kolumnę. Pierwsza z nich, chromatografia oddziaływań hydrofobowych (hydrophobic interaction chro-matography — HIC), przebiega w środowisku wodnym, a odsłonięcie regionów hydrofobowych makromolekuły zachodzi dzięki zastosowaniu dużych stężeń soli. Druga z technik — chromatografia fazy odwróconej (reversed phasc chromato-graphy - RPC), wykorzystuje hydrofobowe właściwości rozpuszczalników organicznych. Różnica w używanych solwentach i eluentach ma istotne znaczenie ze względu na aktywność biologiczną rozdzielanych cząsteczek. Zastosowanie niepolamych rozpuszczalników organicznych w technice RPC prowadzi często do zniszczenia struktur III- i IV-rzędowych. Jest to szczególnie niekorzystne podczas prób izolowania aktywnych postaci enzymów czy receptorów. Do tych celów lepiej wybrać technikę HIC. gdzie izolowane makromolekuły znajdują się cały czas w środowisku wodnym i zachowują aktywność biologiczną. Natomiast w przypadku niewielkich cząsteczek, np. peptydów czy też hormonów, kontakt z niepolarnym środowiskiem rozpuszczalników organicznych nie powoduje istotnych zmian w strukturze przestrzennej i zdecydowanie lepszą metodą jest technika RPC, charakteryzująca się znacznie większą rozdzielczością niż HIC (patrz także: podrozdz. 10.2.8).
4.8.1. Podstawy teoretyczne chromatografii oddziaływań hydrofobowych
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) jest szeroko wykorzystywana do oczyszczania i wyodrębniania makromolekuł białkowych. Białka rozdziela się dzięki różnicy sił ich oddziaływań hydrofobowych z bardzo hydrofobowymi grupami ligandów, trwale umocowanych na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego. Różne czynniki wpływają na zachowanie się cząsteczek białkowych w kontakcie z hydrofobowym adsorbentem: niektóre z nich mają krytyczny wpływ na rozdzielczość i selektywność metody, a także zdolność wiązania się cząsteczek ze złożem. Dalej wymieniono i krótko omówiono najważniejsze czynniki: typ ligandu oraz jego gęstość na powierzchni nośnika, rodzaj nośnika, rodzaj i stężenie soli, pil, temperaturę i skład solwentów.
Typ ligandu unieruchomionego na nośniku (łańcuch alkilowy lub aromatyczne grupy arylowe) determinuje sposób adsorpcji cząsteczek białkowych. W szczególności liniowe łańcuchy alkilowe wykazują zdolność do czysto hydrofobowego oddziaływania, natomiast Ugandy arylowe mają mieszane właściwości, tj. zarówno oddziałują przez liniowe fragmenty łańcucha, jak i wykorzystują wiązania typu n n
167
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
img111 3 Ćwiczenie 4.33. Izolowanie białek surowicy wlt
Laboratorium 3 BIAŁKA SUROWICY KRWI Ćwiczenie 1. Rozdział alektroforetyczny białek surowicy (rry/i p
Laboratorium 3 BIAŁKA SUROWICY KRWI Ćwiczenie 1: Rozdział elektroforetyczny białek surowicy Krwi na
prep biomol skrypt0 Ćwiczenie 3. ( hmmatografia powinowactwa białek plazmy nasienia knura wiążących
prep biomol skrypt1 Izolowanie białek wiążących jony metali Większość cząsteczek białkowych w różny
farmakologia2 jpeg Przykłady białek osocza wiążących leki: albumina, glikoproteina, metalotioneina Z
PRACUJĘ Z SZEŚCIOLATKIEM ZESZYT ĆWICZEŃ (33) 37 Ćwiczenie 14
PRACUJĘ Z SZEŚCIOLATKIEM ZESZYT ĆWICZEŃ (33) 37 Ćwiczenie 14
a) wiążące jony żelaza b) wiążące ATP 0 wiążące
W LITEROLANDII ĆWICZENIA 33 Mfy głos kuj. & inP U/ Hfodpisz obrazki. ŁUzupełnij. &n
Ćwiczenie 12.Frakcjonowanie białek mleka i badanie ich właściwości1 Cel ćwiczenia Podczas ćwiczenia
kulturystyka059 ĆWICZENIE 33 Cel: Przydatne w dysc.: Pozycja wyjściowa: Ruch: Warianty ćwiczenia: ĆW
kulturystyka169 ĆWICZENIE 159 wariant ćwiczenia 33 Pozycja wyjściowa: Opad tułowia przodem do bloczk
więcej podobnych podstron